BS3 Chemical Crosslinking Assay: Bewertung der Wirkung von chronischem Stress auf die Präsentation des_{GABA-A-Rezeptors} auf der Zelloberfläche im Gehirn von Nagetieren

Neurotransmitterrezeptoren sind entweder an der Oberfläche der neuronalen Plasmamembran oder intrazellulär auf den Endomembranen (z. B. dem Endosom, dem endoplasmatischen Retikulum [ER] oder dem trans-Golgi-Apparat) lokalisiert und pendeln dynamisch zwischen diesen beiden Kompartimenten, abhängig von intrinsischen physiologischen Zuständen in Neuronen oder als Reaktion auf extrinsische neuronale Netzwerkaktivitäten ^1,2. Da neu sezernierte Neurotransmitter ihre physiologischen Funktionen in erster Linie über den oberflächenlokalisierten Rezeptorpool hervorrufen, sind die Oberflächenrezeptorspiegel für einen bestimmten Neurotransmitter eine der kritischen Determinanten seiner Signalkapazität innerhalb des neuronalen Schaltkreises³.

Es stehen mehrere Methoden zur Verfügung, um den Oberflächenrezeptorspiegel in kultivierten Neuronen zu überwachen, darunter der Oberflächenbiotinylierungsassay⁴, der Immunfluoreszenz-Assay mit einem spezifischen Antikörper unter nicht-permeabilisierten Bedingungen⁵ oder die Verwendung eines Rezeptortransgens, das genetisch mit einem pH-empfindlichen fluoreszierenden optischen Indikator (z. B. pHluorin⁾ fusioniert ist6. Im Gegensatz dazu sind diese Ansätze bei der Bestimmung von Oberflächenrezeptorspiegeln in vivo entweder begrenzt oder unpraktisch. Beispielsweise ist das Oberflächenbiotinylierungsverfahren aufgrund seines relativ hohen Preises und der nachfolgenden Schritte, die für die Reinigung der biotinylierten Proteine auf Avidin-konjugierten Beads erforderlich sind, möglicherweise nicht für die Verarbeitung großer Mengen und Probenzahlen von In-vivo-Hirngewebe geeignet. Für Neuronen, die in eine dreidimensionale Gehirnarchitektur eingebettet sind, können eine geringe Zugänglichkeit von Antikörpern oder Schwierigkeiten bei der mikroskopischen Quantifizierung eine erhebliche Einschränkung für die Beurteilung der Oberflächenrezeptorkonzentrationen in vivo darstellen. Um die Verteilung von Neurotransmitterrezeptoren in intakten Gehirnen sichtbar zu machen, könnten nicht-invasive Methoden, wie die Positronen-Emissions-Tomographie, verwendet werden, um die Rezeptorbelegung zu messen und die Oberflächenrezeptorspiegel abzuschätzen⁷. Dieser Ansatz hängt jedoch entscheidend von der Verfügbarkeit spezifischer Radioliganden, teurer Ausrüstung und speziellem Fachwissen ab, was ihn für den routinemäßigen Einsatz für die meisten Forscher weniger zugänglich macht.

Hier beschreiben wir eine einfache, vielseitige Methode zur Messung von Oberflächenrezeptorspiegeln in experimentellen Tiergehirnen ex vivo unter Verwendung eines wasserlöslichen, membranundurchlässigen chemischen Vernetzers, Bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BS3)^8,9. BS3 zielt auf primäre Amine in der Seitenkette von Lysinresten ab und kann Proteine in unmittelbarer Nähe zueinander kovalent vernetzen. Wenn Hirnschnitte aus einer Region von Interesse frisch präpariert und in einem BS3-haltigen Puffer inkubiert werden, werden die Rezeptoren auf der Zelloberfläche mit benachbarten Proteinen vernetzt und verwandeln sich so in Spezies mit höherem Molekulargewicht, während die intrazellulären Endomembran-assoziierten Rezeptoren unverändert bleiben. Daher können die Oberflächen- und intrazellulären Rezeptorpools durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt und mittels Western Blot unter Verwendung von Antikörpern, die für den zu untersuchenden Rezeptor spezifisch sind, quantifiziert werden.

Unpredictable chronic mild stress (UCMS) ist ein etabliertes experimentelles Paradigma zur Induktion von chronischem psychosozialem Stress bei Nagetieren¹⁰. UCMS löst angst-/depressive Verhaltensphänotypen und kognitive Defizite durch die Modulation einer Reihe von Neurotransmittersystemen aus, einschließlich GABA und seiner Rezeptoren^10,11. Insbesondere der α5-Untereinheit-enthaltende GABA-A-Rezeptor (α5-GABA_A R) ist an der Regulation des Gedächtnisses und der kognitiven Funktionen beteiligt^12,13, was auf eine mögliche Beteiligung veränderter Funktionen dieser Untereinheit an UCMS-induzierten kognitiven Defiziten hindeutet. In diesem Protokoll haben wir den BS3-Crosslinking-Assay verwendet, um die Konzentrationen von oberflächenexprimiertem α5-GABA_AR im präfrontalen Kortex von Mäusen, die UCMS ausgesetzt waren, im Vergleich zu nicht gestressten Kontrollmäusen zu quantifizieren.