BS3 Chemical Crosslinking Assay: valutazione dell'effetto dello stress cronico sulla superficie cellulare Presentazione del recettore GABA_A nel cervello dei roditori

I recettori dei neurotrasmettitori sono localizzati sulla superficie della membrana plasmatica neuronale o intracellulare sulle endomembrane (ad esempio, l’endosoma, il reticolo endoplasmatico [ER], o l’apparato trans-Golgi) e fanno la spola dinamica tra questi due compartimenti a seconda degli stati fisiologici intrinseci nei neuroni o in risposta alle attività estrinseche della rete neurale ^1,2. Poiché i neurotrasmettitori appena secreti suscitano le loro funzioni fisiologiche principalmente attraverso il pool di recettori localizzato in superficie, i livelli di recettori di superficie per un dato neurotrasmettitore sono uno dei determinanti critici della sua capacità di segnalazione all’interno del circuito neurale³.

Sono disponibili diversi metodi per monitorare i livelli dei recettori di superficie nei neuroni in coltura, tra cui il saggio di biotinilazione superficiale⁴, il saggio di immunofluorescenza con un anticorpo specifico in condizioni non permeabilizzate⁵ o l’uso di un transgene recettore geneticamente fuso con un indicatore ottico fluorescente sensibile al pH (ad esempio, pHluorin)⁶. Al contrario, questi approcci sono limitati o poco pratici quando si valutano i livelli dei recettori di superficie in vivo. Ad esempio, la procedura di biotinilazione superficiale potrebbe non essere pratica per il trattamento di grandi quantità e numeri di campioni di tessuti cerebrali in vivo a causa del suo prezzo relativamente elevato e delle successive fasi necessarie per purificare le proteine biotinilate su perle coniugate con avidina. Per i neuroni incorporati nell’architettura cerebrale tridimensionale, la bassa accessibilità agli anticorpi o le difficoltà nella quantificazione basata sul microscopio possono rappresentare una limitazione significativa per valutare i livelli dei recettori di superficie in vivo. Per visualizzare la distribuzione dei recettori dei neurotrasmettitori nel cervello intatto, metodi non invasivi, come la tomografia ad emissione di positroni, potrebbero essere utilizzati per misurare l’occupazione dei recettori e stimare^{i livelli 7} del recettore di superficie. Tuttavia, questo approccio si basa in modo critico sulla disponibilità di leganti radio specifici, apparecchiature costose e competenze speciali, rendendolo meno accessibile per l’uso di routine da parte della maggior parte dei ricercatori.

Qui, descriviamo un metodo semplice e versatile per misurare i livelli di recettori di superficie in cervelli animali sperimentali ex vivo utilizzando un reticolante chimico solubile in acqua e impermeabile alla membrana, bis(sulfosuccinimidil)suberato (BS3)^8,9. BS3 prende di mira le ammine primarie nella catena laterale dei residui di lisina e può reticolare covalentemente le proteine in prossimità l’una dell’altra. Quando le fette di cervello sono appena preparate da una regione di interesse e incubate in un tampone contenente BS3, i recettori della superficie cellulare sono reticolati con le proteine vicine e, quindi, si trasformano in specie ad alto peso molecolare, mentre i recettori associati all’endomembrana intracellulare rimangono invariati. Pertanto, i pool di recettori di superficie e intracellulari possono essere separati mediante elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) e quantificati mediante western blot utilizzando anticorpi specifici per il recettore da studiare.

Lo stress cronico lieve imprevedibile (UCMS) è un paradigma sperimentale ben consolidato per indurre stress psicosociale cronico nei roditori¹⁰. UCMS suscita fenotipi comportamentali ansiosi / depressivi e deficit cognitivi attraverso la modulazione di una serie di sistemi di neurotrasmettitori, tra cui GABA e i suoi recettori^10,11. In particolare, il recettore GABA A contenente subunità α5 (α5-GABA_AR) è implicato nella regolazione della memoria e delle funzioni cognitive^12,13, suggerendo il possibile coinvolgimento di funzioni alterate di questa subunità nei deficit cognitivi indotti da UCMS. In questo protocollo, abbiamo utilizzato il test di crosslinking BS3 per quantificare i livelli di α5-GABA_AR espressi in superficie nella corteccia prefrontale dei topi esposti a UCMS rispetto ai topi di controllo non stressati.