Hypothalamische kisspeptine-neuronen als doelwit voor patchklem-opnames met hele cellen

Hodgkin en Huxley maakten het eerste intracellulaire record van een actiepotentiaal beschreven in verschillende wetenschappelijke studies. Deze opname werd uitgevoerd op het inktvis-axon, dat een grote diameter heeft (~ 500 μm), waardoor een micro-elektrode in het axon kan worden geplaatst. Dit werk bood grote mogelijkheden voor wetenschappelijk onderzoek, later culminerend in de creatie van de spanningsklemmodus, die werd gebruikt om de ionische basis van actiepotentiaalgeneratie 1,2,3,4,5,6,7,8 te bestuderen. In de loop der jaren is de techniek verbeterd en op grote schaal toegepast in wetenschappelijk onderzoek ^6,9. De uitvinding van de patch-clamp-techniek, die plaatsvond in de late jaren 1970 door studies geïnitieerd door Erwin Neher en Bert Sakmann, stelde onderzoekers in staat om enkele ionkanalen en intracellulaire membraanpotentialen of -stromen in vrijwel elk type cel vast te leggen met behulp van slechts een enkele elektrode 9,10,11,12 . Patch-clamp-opnamen kunnen worden gemaakt op verschillende weefselpreparaten, zoals gekweekte cellen of weefselplakken, in spanningsklemmodus (waarbij het celmembraan op een ingestelde spanning wordt gehouden waardoor bijvoorbeeld spanningsafhankelijke stromen en synaptische stromen kunnen worden geregistreerd) of stroomklemmodus (waardoor bijvoorbeeld veranderingen in rustmembraanpotentiaal geïnduceerd door ionenstromen kunnen worden geregistreerd, actiepotentialen en postsynaptische potentiaalfrequentie).

Het gebruik van de patch-clamp techniek maakte verschillende opmerkelijke ontdekkingen mogelijk. Inderdaad, de baanbrekende bevindingen over de elektrofysiologische eigenschappen van hypothalamische kisspeptine-neuronen gelegen op de anteroventrale periventriculaire en rostrale periventriculaire kernen (AVPV / PeN Kisspeptin), ook bekend als het rostrale periventriculaire gebied van de derde ventrikel (RP3V), en de boogvormige kern van de hypothalamus (ARH^kisspeptin)^13,14,15 zijn van bijzonder belang. In 2010 voerden Ducret et al. de eerste opnames uit van AVPV / PeN^{Kisspeptine-neuronen}in muizen met behulp van een ander elektrofysiologisch hulpmiddel, de lose-cell patch-clamp-techniek. Deze studies gaven een elektrische beschrijving van AVPV / PeN^{Kisspeptine-neuronen} en toonden aan dat hun vuurpatronen afhankelijk zijn van de oestruscyclus-afhankelijke¹⁶. In 2011 gebruikten Qiu et al. de hele cel patch-clamp-techniek om aan te tonen dat ARH^kisspeptin neuronen endogene pacemakerstromen tot expressie brengen¹⁷. Vervolgens toonden Gottsch et al. aan dat kisspeptine-neuronen spontane activiteit vertonen en zowel h-type (pacemaker) als T-type calciumstromen tot expressie brengen, wat suggereert dat ARH^{kisspeptine-neuronen} elektrofysiologische eigenschappen delen met andere pacemakerneuronen van het centrale zenuwstelsel¹⁸. Bovendien is aangetoond dat ARH^{kisspeptine-neuronen} seksueel dimorfe vuursnelheden vertonen en dat AVPV / PeN^{Kisspeptine-neuronen} een bimodaal rustmembraanpotentiaal (RMP) vertonen dat wordt beïnvloed door ATP-gevoelige kaliumkanalen (K_ATP)^19,20. Bovendien werd vastgesteld dat gonadale steroïden de spontane elektrische activiteit van de kisspeptine-neuronen bij muizen positief beïnvloeden 19,20,21. De eerste werken die de elektrofysiologische eigenschappen van kisspeptine-neuronen bestuderen, worden genoemd 16,17,18,19,20. Sindsdien hebben veel studies de whole-cell patch-clamp techniek gebruikt om aan te tonen welke factoren/neuromodulatoren voldoende zijn om de elektrische activiteit van kisspeptin neuronen te moduleren (Figuur 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,^31,32.

Gezien het belang van deze techniek voor de studie van neuronen die nodig zijn voor reproductie, naast andere celtypen die hier niet worden behandeld, beschrijft dit artikel de basisstappen voor de ontwikkeling van de patch-clamp-techniek van de hele cel, zoals het voorbereiden van de oplossingen, het ontleden en snijden van de hersenen en het uitvoeren van de afdichting van het celmembraan voor opnames. Bovendien worden relevante kwesties over de techniek besproken, zoals de voordelen, technische beperkingen en belangrijke variabelen die moeten worden gecontroleerd voor optimale experimentele prestaties.