Neurônios Kisspeptin Hipotalâmicos como Alvo para Gravações de Patch-Clamp de Células Inteiras

Hodgkin e Huxley fizeram o primeiro registro intracelular de um potencial de ação descrito em vários estudos científicos. Este registro foi realizado no axônio da lula, que tem um grande diâmetro (~500 μm), permitindo que um microeletrodo seja colocado dentro do axônio. Este trabalho proporcionou grandes possibilidades para a pesquisa científica, culminando posteriormente com a criação do modo tensão-pinça, que foi utilizado para estudar a base iônica da geração do potencial de ação 1,2,3,4,5,6,7,8. Com o passar dos anos, a técnica foi se aprimorando, tornando-se amplamente aplicada em pesquisas^{científicas6,9}. A invenção da técnica patch-clamp, ocorrida no final da década de 1970 por meio de estudos iniciados por Erwin Neher e Bert Sakmann, permitiu aos pesquisadores registrar canais iônicos únicos e potenciais ou correntes de membrana intracelular em praticamente todos os tipos celulares utilizando apenas um eletrodo 9,10,11,12. Os registos de patch-clamp podem ser feitos numa variedade de preparações de tecidos, tais como células cultivadas ou cortes de tecido, quer em modo voltage-clamp (mantendo a membrana celular a uma tensão definida que permite o registo, por exemplo, de correntes dependentes de voltagem e correntes sinápticas) quer em modo corrente-clamp (permitindo o registo de, por exemplo, alterações no potencial de membrana de repouso induzidas por correntes iónicas, potenciais de ação e frequência potencial pós-sináptico).

O uso da técnica patch-clamp possibilitou várias descobertas notáveis. De fato, os achados seminais sobre as propriedades eletrofisiológicas dos neurônios kisspeptina hipotalâmico localizados nos núcleos periventricular anteroventral e periventricular rostral (VPVV/PeN Kisspeptina), também conhecidos como área periventricular rostral do terceiro ventrículo (RP3V), e núcleo arqueado do hipotálamo (ARH^kisspeptina)^13,14,15 são de particular interesse. Em 2010, Ducret e colaboradores realizaram os primeiros registros de neurônios de^KisspeptinAVPV/PeN em camundongos usando outra ferramenta eletrofisiológica, a técnica de patch-clamp de células soltas. Esses estudos forneceram uma descrição elétrica dos neurônios^Kisspeptin AVPV/PeN e demonstraram que seus padrões de disparo são dependentes do ciclo estral¹⁶. Em 2011, Qiu e col. utilizaram a técnica de patch-clamp de células inteiras para demonstrar que os neurônios da^kisspeptina ARH expressam correntes endógenas de marcapasso¹⁷. Posteriormente, Gottsch e col. mostraram que os neurônios kisspeptin exibem atividade espontânea e expressam correntes de cálcio do tipo h (marca-passo) e do tipo T, sugerindo que os neurônios da^kisspeptina ARH compartilham propriedades eletrofisiológicas com outros neurônios marca-passo do sistema nervoso^central18. Além disso, foi demonstrado que os neurônios da kisspeptina ARH exibem taxas de disparo sexualmente dimórficas e que os neurônios da^Kisspeptina AVPV/PeN exibem um potencial de membrana de repouso (RMP) bimodal influenciado por canais de potássio sensíveis ao ATP (K_ATP)^19,20. Além disso, foi estabelecido que os esteroides gonadais afetam positivamente a atividade elétrica espontânea dos neurônios kisspeptin em camundongos 19,20,21. São citados os primeiros trabalhos que estudam as propriedades eletrofisiológicas dos neurônios kisspeptina 16,17,18,19,20. Desde então, muitos estudos têm utilizado a técnica de patch-clamp de células inteiras para demonstrar quais fatores/neuromoduladores são suficientes para modular a atividade elétrica dos neurônios kisspeptin (Figura 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,^31,32.

Dada a importância dessa técnica para o estudo dos neurônios necessários para a reprodução, entre outros tipos celulares não abordados aqui, este artigo descreve os passos básicos para o desenvolvimento da técnica de patch-clamp de células inteiras, como preparar as soluções, dissecar e fatiar o cérebro e realizar o selamento da membrana celular para registros. Além disso, questões relevantes sobre a técnica são discutidas, como suas vantagens, limitações técnicas e variáveis importantes que devem ser controladas para um ótimo desempenho experimental.