Neuroni ipotalamici di kisspeptina come bersaglio per le registrazioni di patch-clamp a cellule intere

Hodgkin e Huxley hanno fatto la prima registrazione intracellulare di un potenziale d’azione descritto in diversi studi scientifici. Questa registrazione è stata eseguita sull’assone del calamaro, che ha un grande diametro (~ 500 μm), consentendo di posizionare un microelettrodo all’interno dell’assone. Questo lavoro ha fornito grandi possibilità per la ricerca scientifica, culminando in seguito nella creazione del modo di morsetto di tensione, che è stato utilizzato per studiare la base ionica della generazione del potenziale d’azione 1,2,3,4,5,6,7,8. Nel corso degli anni, la tecnica è stata migliorata ed è diventata ampiamente applicata nella ricerca scientifica ^6,9. L’invenzione della tecnica patch-clamp, avvenuta alla fine del 1970 attraverso studi avviati da Erwin Neher e Bert Sakmann, ha permesso ai ricercatori di registrare singoli canali ionici e potenziali o correnti di membrana intracellulare praticamente in ogni tipo di cellula utilizzando un solo elettrodo 9,10,11,12. Le registrazioni patch-clamp possono essere effettuate su una varietà di preparati tissutali, come cellule coltivate o fette di tessuto, in modalità tension-clamp (mantenendo la membrana cellulare a una tensione impostata che consente la registrazione, ad esempio, di correnti dipendenti dalla tensione e correnti sinaptiche) o in modalità current-clamp (consentendo la registrazione, ad esempio, delle variazioni del potenziale di membrana a riposo indotte da correnti ioniche, potenziali d’azione e frequenza del potenziale postsinaptico).

L’uso della tecnica patch-clamp ha reso possibili diverse scoperte degne di nota. Infatti, i risultati seminali sulle proprietà elettrofisiologiche dei neuroni ipotalamici kisspeptin situati nei nuclei periventricolare anteroventrale e periventricolare rostrale (AVPV / PeN Kisspeptin), noto anche come area periventricolare rostrale del terzo ventricolo (RP3V), e il nucleo arcuato dell’ipotalamo (ARH^kisspeptin)^13,14,15 sono di particolare interesse. Nel 2010, Ducret et al. hanno eseguito le prime registrazioni di neuroni AVPV / PeN^Kisspeptinnei topi utilizzando un altro strumento elettrofisiologico, la tecnica patch-clamp a cellule sciolte. Questi studi hanno fornito una descrizione elettrica dei neuroni AVPV/PeN^Kisspeptin e hanno dimostrato che i loro schemi di attivazione sono estrali dipendenti dal ciclo¹⁶. Nel 2011, Qiu et al. hanno utilizzato la tecnica dell’intero patch-clamp cellulare per dimostrare che i neuroni ARH^kisspeptin esprimono correnti pacemaker endogene¹⁷. Successivamente, Gottsch et al. hanno dimostrato che i neuroni kisspeptin mostrano attività spontanea ed esprimono sia correnti di calcio di tipo H (pacemaker) che di tipo T, suggerendo che i neuroni ARH^kisspeptin condividono proprietà elettrofisiologiche con altri neuroni pacemaker del sistema nervoso centrale¹⁸. Inoltre, è stato dimostrato che i neuroni ARH kisspeptin mostrano velocità di attivazione sessualmente dimorfiche e che i neuroni AVPV/PeN^Kisspeptin mostrano un potenziale di membrana a riposo bimodale (RMP) influenzato dai canali del potassio sensibili all’ATP (K_ATP)^19,20. Inoltre, è stato stabilito che gli steroidi gonadici influenzano positivamente l’attività elettrica spontanea dei neuroni kisspeptina nei topi 19,20,21. I primi lavori che studiano le proprietà elettrofisiologiche dei neuroni kisspeptina sono menzionati 16,17,18,19,20. Da allora, molti studi hanno utilizzato la tecnica patch-clamp dell’intera cellula per dimostrare quali fattori/neuromodulatori sono sufficienti a modulare l’attività elettrica dei neuroni kisspeptina (Figura 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,^31,32.

Data l’importanza di questa tecnica per lo studio dei neuroni necessari per la riproduzione, tra gli altri tipi di cellule non trattati qui, questo articolo descrive i passaggi fondamentali per lo sviluppo della tecnica patch-clamp dell’intera cellula, come la preparazione delle soluzioni, la dissezione e il taglio del cervello e l’esecuzione del sigillo della membrana cellulare per le registrazioni. Inoltre, vengono discusse questioni rilevanti sulla tecnica, come i suoi vantaggi, i limiti tecnici e le variabili importanti che devono essere controllate per prestazioni sperimentali ottimali.