נוירוני קיספפטין היפותלמיים כיעד להקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע מהדק טלאי של תאים שלמים על פרוסות מוח המכילות נוירוני קיספפטין, המודולטור העיקרי של תאי הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH). על ידי הוספת ידע על פעילות נוירוני קיספפטין, כלי אלקטרופיזיולוגי זה שימש בסיס להתקדמות משמעותית בתחום הנוירואנדוקרינולוגיה במהלך 20 השנים האחרונות.
Abstract
קיספפטינים חיוניים להבשלת ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-גונדל (HPG) ולפוריות. נוירוני קיספפטין היפותלמיים הממוקמים בגרעין הפריוונטריקולרי האנטרו-ונטרלי ובגרעין הפריוונטריקולרי הרוסטרלי, כמו גם בגרעין ארקואט של ההיפותלמוס, מקרינים לנוירונים משחררי הורמונים גונדוטרופינים (GnRH), בין תאים אחרים. מחקרים קודמים הראו כי איתות קיספפטין מתרחש דרך קולטן Kiss1 (Kiss1r), מה שבסופו של דבר מעורר פעילות נוירונים GnRH. בבני אדם ובמודלים ניסיוניים של בעלי חיים, קיספפטין מספיקים לגרימת הפרשת GnRH, וכתוצאה מכך, שחרור הורמון מחלמן (LH) והורמון ממריץ זקיקים (FSH). מאחר שקיספפטינים ממלאים תפקיד חיוני בתפקודי הרבייה, חוקרים עובדים כדי להעריך כיצד הפעילות הפנימית של נוירוני קיספפטין היפותלמיים תורמת לפעולות הקשורות לרבייה ולזהות את המוליכים העצביים/נוירומודולטורים העיקריים המסוגלים לשנות תכונות אלה. טכניקת הידוק המדבקים של כל התא הפכה לכלי רב ערך לחקר פעילות נוירוני קיספפטין בתאי מכרסמים. טכניקה ניסיונית זו מאפשרת לחוקרים להקליט ולמדוד זרמים יוניים מעוררים ומעכבים ספונטניים, פוטנציאל קרום מנוחה, ירי פוטנציאלי פעולה ותכונות אלקטרופיזיולוגיות אחרות של קרום התא. במחקר הנוכחי נסקרים היבטים מכריעים של טכניקת מהדק טלאי של כל התא, הידועה כמדידות אלקטרופיזיולוגיות המגדירות נוירונים קיספפטין היפותלמיים, ודיון בסוגיות רלוונטיות לגבי הטכניקה.
Introduction
הודג’קין והאקסלי ערכו את התיעוד התוך-תאי הראשון של פוטנציאל פעולה שתואר במספר מחקרים מדעיים. הקלטה זו בוצעה על אקסון הדיונון, בעל קוטר גדול (~500 מיקרומטר), המאפשר למקם מיקרואלקטרודה בתוך האקסון. עבודה זו סיפקה אפשרויות גדולות למחקר מדעי, שמאוחר יותר הגיע לשיאו ביצירת מצב מהדק מתח, ששימש לחקר הבסיס היוני של יצירת פוטנציאל פעולה 1,2,3,4,5,6,7,8. במהלך השנים, הטכניקה שופרה, והיא הפכה להיות מיושמת באופן נרחב במחקר מדעי 6,9. המצאת טכניקת מהדק הטלאים, שהתרחשה בסוף שנות השבעים באמצעות מחקרים שיזמו ארווין נהר וברט סאקמן, אפשרה לחוקרים להקליט תעלות יונים בודדות ופוטנציאלים או זרמים של קרום תוך תאי כמעט בכל סוג של תא באמצעות אלקטרודה אחת בלבד 9,10,11,12. הקלטות מהדק טלאי יכולות להתבצע על מגוון תכשירי רקמות, כגון תאים בתרבית או פרוסות רקמה, במצב מהדק מתח (החזקת קרום התא במתח מוגדר המאפשר הקלטה, למשל, של זרמים תלויי מתח וזרמים סינפטיים) או במצב מהדק זרם (המאפשר הקלטה, למשל, של שינויים בפוטנציאל קרום המנוחה המושרה על ידי זרמי יונים, פוטנציאלי פעולה, ותדירות פוטנציאל פוסט-סינפטי).
השימוש בטכניקת מהדק הטלאי איפשר מספר תגליות בולטות. ואכן, הממצאים הראשוניים על התכונות האלקטרופיזיולוגיות של נוירוני קיספפטין היפותלמיים הממוקמים בגרעינים הפריוונטריקולריים האנטרו-ונטרליים (AVPV/PeNKisspeptin), הידוע גם בשם האזור הפרי-חדרי הרוסטרלי של החדר השלישי (RP3V), וגרעין הארקואט של ההיפותלמוס (ARHkisspeptin)13,14,15 הם בעלי עניין מיוחד. בשנת 2010, Ducret et al. ביצעו את ההקלטות הראשונות של נוירונים AVPV/PeNKisspeptinבעכברים באמצעות כלי אלקטרופיזיולוגי אחר, טכניקת מהדק טלאי תאים רופפים. מחקרים אלה סיפקו תיאור חשמלי של נוירוניקיספטין AVPV/PeN והראו כי דפוסי הירי שלהם תלויים במחזור הייחום16. בשנת 2011, Qiu et al. השתמשו בטכניקת מהדק טלאי התא כולו כדי להדגים כי נוירוניקיספפטין ARH מבטאים זרמי קוצב לב אנדוגניים17. לאחר מכן, גוטש ועמיתיו הראו כי נוירוני קיספפטין מפגינים פעילות ספונטנית ומבטאים הן זרמי סידן מסוג H (קוצב לב) והן זרמי סידן מסוג T, דבר המצביע על כך שנוירוניקיספפטין ARH חולקים תכונות אלקטרופיזיולוגיות עם נוירוני קוצב אחרים של מערכת העצבים המרכזית18. בנוסף, הוכח כי נוירוניקיספפטין ARH מפגינים קצבי ירי דימורפיים מינית וכי נוירוניקיספטין AVPV/PeN מפגינים פוטנציאל קרום מנוחה בימודאלי (RMP) המושפע מתעלות אשלגן רגישות ל-ATP (KATP)19,20. יתר על כן, נקבע כי סטרואידים גונדל משפיעים באופן חיובי על הפעילות החשמלית הספונטנית של נוירוני קיספפטין בעכברים 19,20,21. העבודות הראשונות החוקרות את התכונות האלקטרופיזיולוגיות של נוירוני קיספפטין מוזכרות 16,17,18,19,20. מאז, מחקרים רבים השתמשו בטכניקת מהדק טלאי של כל התא כדי להדגים אילו גורמים/נוירומודולטורים מספיקים כדי לווסת את הפעילות החשמלית של נוירוני קיספפטין (איור 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.
בהתחשב בחשיבותה של טכניקה זו לחקר תאי עצב הדרושים להתרבות, בין סוגי תאים אחרים שאינם מכוסים כאן, מאמר זה מתאר את השלבים הבסיסיים לפיתוח טכניקת מהדק טלאי התא כולו, כגון הכנת התמיסות, ניתוח וחיתוך המוח, וביצוע אטימת קרום התא להקלטות. יתר על כן, נדונים נושאים רלוונטיים לגבי הטכניקה, כגון יתרונותיה, מגבלות טכניות ומשתנים חשובים שיש לשלוט בהם לביצוע ניסויי אופטימלי.
Protocol
Representative Results
Discussion
לפיתוח טכניקת מהדק המדבקים של התא כולו הייתה השפעה משמעותית על הקהילה המדעית, והיא נחשבה לבעלת חשיבות עליונה לפיתוח המחקר המדעי ואפשרה מספר תגליות. השפעתה על המדע הספיקה כדי להגיע לשיאה בפרס נובל לרפואה בשנת 1991, שכן תגלית זו פתחה את הדלת להבנה טובה יותר של האופן שבו תעלות יונים מתפקדות בתנ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר של סאו פאולו [מספרי מענק FAPESP: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); ועל ידי Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Finance Code 001″ (HRV).
Materials
| Compounds for aCSF, internal and slicing solutions | |||
| ATP | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich/various | C7902 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich/various | G7021 | |
| EGTA | Sigma Aldrich/various | O3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| KCL | Sigma Aldrich/various | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma Aldrich/various | G4500 | |
| KOH | Sigma Aldrich/various | P5958 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich/various | M9272 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich/various | 230391 | |
| NaCl | Sigma Aldrich/various | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich/various | S5011 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich/various | S5761 | |
| nitric acid | Sigma Aldrich/various | 225711 | CAUTION |
| Sucrose | Sigma Aldrich/various | S1888 | |
| Equipments | |||
| Air table | TMC | 63-534 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Computer | various | – | |
| DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM | Molecular Devices | DD1440 | |
| Digital peristaltic pump | Ismatec | ISM833C | |
| Faraday cage | TMC | 81-333-03 | |
| Imaging Camera | Leica | DFC 365 FX | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | Roe-200 | |
| Micropipette Puller | Narishige | PC-10 | |
| Microscope | Leica | DM6000 FS | |
| Osteotome | Bonther equipamentos & Tecnologia/various | 128 | |
| Recovery chamber | Warner Instruments/Harvard apparatus | – | can be made in-house |
| Recording chamber | Warner Instruments | 640277 | |
| Spatula | Fisher Scientific /various | FISH-14-375-10; FISH-21-401-20 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| Water Bath | Fisher Scientific /various | Isotemp | |
| Software and systems | |||
| AxoScope 10 software | Molecular Devices | – | Commander Software |
| LAS X wide field system | Leica | – | Image acquisition and analysis |
| MultiClamp 700B | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | Commander Software |
| PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS | Molecular Devices | Pclamp 10 Standard | |
| Tools | |||
| Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm | Warner Instruments | 64-1309 | |
| Curved hemostatic forcep | various | – | |
| cyanoacrylate glue | LOCTITE/various | – | |
| Decapitation scissors | various | – | |
| Filter paper | various | – | |
| Glass capillaries (micropipette) | World Precision Instruments, Inc | TW150F-4 | |
| Iris scissors | Bonther equipamentos & Tecnologia/various | 65-66 | |
| Pasteur glass pipette | Sigma Aldrich/various | CLS7095B9-1000EA | |
| Petri dish | various | – | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0756 | |
| Razor blade for brain dissection | TED PELLA | TEDP-121-1 | |
| Razor blade for the vibratome | TED PELLA | TEDP-121-9 | |
| Scissors | Bonther equipamentos & Tecnologia/various | 71-72, 48,49; | |
| silicone teat | various | – | |
| Slice Anchor | Warner Instruments | 64-0246 | |
| Syringe filters | Merck Millipore Ltda | SLGVR13SL | Millex-GV 0.22 μm |
| Tweezers | Bonther equipamentos & Tecnologia/various | 131, 1518 |
References
- Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
- Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
- Gandini, M. A., Sandoval, A., Felix, R. Patch-clamp recording of voltage-sensitive Ca2+ channels. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 329-325 (2014).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
- Suk, H. J., Boyden, E. S., van Welie, I. Advances in the automation of whole-cell patch clamp technology. Journal of Neuroscience Methods. 326, 108357 (2019).
- Cole, K. S., Curtis, H. J. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
- Bernstein, J. Ueber den zeitlichen Verlauf der negativen Schwankung des Nervenstroms. Pflüger, Archiv für die Gesammte Physiologie des Menschen und der Thiere. 1 (1), 173-207 (1868).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv. 391 (2), 85-100 (1981).
- Hill, C. L., Stephens, G. J. An introduction to patch clamp recording. Methods in Molecular Biology. 2188, 1-19 (2021).
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
- Smith, J. T., Cunningham, M. J., Rissman, E. F., Clifton, D. K., Steiner, R. A. Regulation of Kiss1 gene expression in the brain of the female mouse. Endocrinology. 146 (9), 3686-3692 (2005).
- Smith, J. T., et al. Differential regulation of KiSS-1 mRNA expression by sex steroids in the brain of the male mouse. Endocrinology. 146 (7), 2976-2984 (2005).
- Ducret, E., Gaidamaka, G., Herbison, A. E. Electrical and morphological characteristics of anteroventral periventricular nucleus kisspeptin and other neurons in the female mouse. Endocrinology. 151 (5), 2223-2232 (2010).
- Qiu, J., Fang, Y., Bosch, M. A., Rønnekleiv, O. K., Kelly, M. J. Guinea pig kisspeptin neurons are depolarized by leptin via activation of TRPC channels. Endocrinology. 152 (4), 1503-1514 (2011).
- Gottsch, M. L., et al. Molecular properties of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the mouse. Endocrinology. 152 (11), 4298-4309 (2011).
- de Croft, S., et al. Spontaneous kisspeptin neuron firing in the adult mouse reveals marked sex and brain region differences but no support for a direct role in negative feedback. Endocrinology. 153 (11), 5384-5393 (2012).
- Frazão, R., et al. Shift in Kiss1 cell activity requires estrogen receptor alpha. The Journal of Neuroscience. 33 (7), 2807-2820 (2013).
- DeFazio, R. A., Elias, C. F., Moenter, S. M. GABAergic transmission to kisspeptin neurons is differentially regulated by time of day and estradiol in female mice. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16296-16308 (2014).
- Mansano, N. D. S., et al. Vasoactive intestinal peptide exerts an excitatory effect on hypothalamic kisspeptin neurons during estrogen negative feedback. Molecular and Cellular Endocrinology. 542, 111532 (2022).
- Jamieson, B. B., Piet, R. Kisspeptin neuron electrophysiology: Intrinsic properties, hormonal modulation, and regulation of homeostatic circuits. Frontiers in Neuroendocrinology. 66, 101006 (2022).
- Silveira, M. A., et al. STAT5 signaling in kisspeptin cells regulates the timing of puberty. Molecular and Cellular Endocrinology. 448, 55-65 (2017).
- Silveira, M. A., et al. Acute effects of somatomammotropin hormones on neuronal components of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. Brain Research. 1714, 210-217 (2019).
- Cravo, R. M., et al. Leptin signaling in Kiss1 neurons arises after pubertal development. PLoS One. 8 (3), e58698 (2013).
- Manfredi-Lozano, M., et al. Defining a novel leptin-melanocortin-kisspeptin pathway involved in the metabolic control of puberty. Molecular Metabolism. 5 (10), 844-857 (2016).
- Qiu, J., et al. Insulin excites anorexigenic proopiomelanocortin neurons via activation of canonical transient receptor potential channels. Cell Metabolism. 19 (4), 682-693 (2014).
- de Croft, S., Boehm, U., Herbison, A. E. Neurokinin B activates arcuate kisspeptin neurons through multiple tachykinin receptors in the male mouse. Endocrinology. 154 (8), 2750-2760 (2013).
- Frazao, R., et al. Estradiol modulates Kiss1 neuronal response to ghrelin. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (6), E606-E614 (2014).
- True, C., Verma, S., Grove, K. L., Smith, M. S. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript is a potent stimulator of GnRH and kisspeptin cells and may contribute to negative energy balance-induced reproductive inhibition in females. Endocrinology. 154 (8), 2821-2832 (2013).
- Navarro, V. M., et al. Regulation of NKB pathways and their roles in the control of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the male mouse. Endocrinology. 152 (11), 4265-4275 (2011).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024 (2016).
- Gibson, A. G., Jaime, J., Burger, L. L., Moenter, S. M. Prenatal androgen treatment does not alter the firing activity of hypothalamic arcuate kisspeptin neurons in female mice. eNeuro. 8 (5), (2021).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain. Stereotaxic Coordinates. 2nd edition. , (2001).
- Cravo, R. M., et al. Characterization of Kiss1 neurons using transgenic mouse models. Neuroscience. 173, 37-56 (2011).
- Emane, M. N., Delouis, C., Kelly, P. A., Djiane, J. Evolution of prolactin and placental lactogen receptors in ewes during pregnancy and lactation. Endocrinology. 118 (2), 695-700 (1986).
- Fuh, G., Colosi, P., Wood, W. I., Wells, J. A. Mechanism-based design of prolactin receptor antagonists. The Journal of Biological Chemistry. 268 (8), 5376-5381 (1993).
- Barinaga, M. Ion channel research wins physiology Nobel. Science. 254 (5030), 380 (1991).
- Colquhoun, D. Neher and Sakmann win Nobel Prize for patch-clamp work. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (12), 449 (1991).
- Greger, R. Nobel Prize for Medicine and Physiology 1991. Analysis of the function of single ion channel. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 116 (48), 1849-1851 (1991).
- Brau, M. E., Vogel, W., Hempelmann, G. Possible applications of the "patch-clamp" method in anesthesiologic research; comment. Anasthesiologie, Intensivmedizin, Notfallmedizin, Schmerztherapie. 31 (9), 537-542 (1996).
- Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods in Enzymology. 207, 3-14 (1992).
- Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
- Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Scientific American. 266 (3), 44-51 (1992).
- Sachs, F., Auerbach, A. Single-channel electrophysiology: use of the patch clamp. Methods in Enzymology. 103, 147-176 (1983).
- Dallas, M., Bell, D. . Patch Clamp Electrophysiology: Methods and Protocols. 1st edition. , (2021).
- Robinson, R. A., Stokes, R. H. . Electrolyte Solutions. 2nd edition. , (1959).
- de Souza, G. O., et al. Gap junctions regulate the activity of AgRP neurons and diet-induced obesity in male mice. The Journal of Endocrinology. 255 (2), 75-90 (2022).
- Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
- Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
- Pan, J. T., Li, C. S., Tang, K. C., Lin, J. Y. Low calcium/high magnesium medium increases activities of hypothalamic arcuate and suprachiasmatic neurons in brain tissue slices. Neuroscience Letters. 144 (1-2), 157-160 (1992).
- Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patch-clamp recording. Annual Review of Physiology. 59, 621-631 (1997).
- Herbison, A. E., Moenter, S. M. Depolarising and hyperpolarising actions of GABA(A) receptor activation on gonadotrophin-releasing hormone neurones: towards an emerging consensus. Journal of Neuroendocrinology. 23 (7), 557-569 (2011).
- Qiu, J., et al. High-frequency stimulation-induced peptide release synchronizes arcuate kisspeptin neurons and excites GnRH neurons. eLife. 5, e16246 (2016).
- Chaves, F. M., Mansano, N. S., Frazão, R., Donato, J. Tumor necrosis factor α and interleukin-1β acutely inhibit AgRP neurons in the arcuate nucleus of the hypothalamus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 8928 (2020).
- Chaves, F. M., et al. Effects of the isolated and combined ablation of growth hormone and IGF-1 receptors in somatostatin neurons. Endocrinology. 163 (5), 045 (2022).
- Wasinski, F., et al. Growth hormone receptor in dopaminergic neurones regulates stress-induced prolactin release in male mice. Journal of Neuroendocrinology. 33 (3), e12957 (2021).
- Furigo, I. C., Ramos-Lobo, A. M., Frazao, R., Donato, J. Brain STAT5 signaling and behavioral control. Molecular and Cellular Endocrinology. 438, 70-76 (2016).
- Zampieri, T. T., et al. Postnatal overnutrition induces changes in synaptic transmission to leptin receptor-expressing neurons in the arcuate nucleus of female mice. Nutrients. 12 (8), 2425 (2020).
- Furigo, I. C., et al. Growth hormone regulates neuroendocrine responses to weight loss via AgRP neurons. Nature Communication. 10 (1), 662 (2019).
