Summary

TACI: Un plugin de ImageJ para el análisis de imágenes de calcio 3D

Published: December 16, 2022
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Summary

TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) es un complemento de código abierto de ImageJ para el análisis de imágenes de calcio en 3D que examina el movimiento en el eje z e identifica el valor máximo de cada pila z para representar la intensidad de una celda en el punto de tiempo correspondiente. Puede separar neuronas que se superponen en la dirección lateral (x / y) pero en diferentes planos z.

Abstract

La investigación en neurociencia ha evolucionado para utilizar imágenes complejas y herramientas computacionales para extraer información completa de conjuntos de datos. La imagen de calcio es una técnica ampliamente utilizada que requiere un software sofisticado para obtener resultados confiables, pero muchos laboratorios luchan por adoptar métodos computacionales al actualizar los protocolos para cumplir con los estándares modernos. Las dificultades surgen debido a la falta de conocimientos de programación y paywalls para el software. Además, las células de interés muestran movimientos en todas las direcciones durante las imágenes de calcio. Se han desarrollado muchos enfoques para corregir el movimiento en la dirección lateral (x / y).

Este documento describe un flujo de trabajo utilizando un nuevo complemento de ImageJ, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), para examinar el movimiento en el eje z en imágenes de calcio 3D. Este software identifica el valor máximo de fluorescencia de todas las posiciones z en las que aparece una neurona y lo utiliza para representar la intensidad de la neurona en la posición t correspondiente. Por lo tanto, esta herramienta puede separar neuronas que se superponen en la dirección lateral (x / y) pero que aparecen en distintos planos z. Como complemento de ImageJ, TACI es una herramienta computacional de código abierto fácil de usar para el análisis de imágenes de calcio en 3D. Validamos este flujo de trabajo utilizando neuronas termosensibles larvales de mosca que mostraban movimientos en todas las direcciones durante la fluctuación de la temperatura y un conjunto de datos de imágenes de calcio en 3D adquiridos del cerebro de la mosca.

Introduction

El nivel de calcio intracelular es un marcador preciso de excitabilidad neuronal. La imagen de calcio mide los cambios en el calcio intracelular para comprender la actividad neuronal1. Los estudios en neurociencia han utilizado cada vez más este método debido al desarrollo de técnicas para medir la concentración intracelular de calcio, incluidos los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI), como GCaMP2,3, que pueden expresarse de forma no invasiva en conjuntos específicos de neuronas a través de enfoques genéticos. Los menores costos de los láseres y los componentes del microscopio también han aumentado el uso de imágenes de calcio4. Es importante destacar que las imágenes de calcio permiten registrar y estudiar neuronas individuales, así como grandes poblaciones de neuronas simultáneamente en animales que se mueven libremente5.

Sin embargo, el análisis de los datos de imágenes de calcio es desafiante porque (1) implica rastrear los cambios en la fluorescencia de las células individuales a lo largo del tiempo, (2) la señal de fluorescencia desaparece intermitentemente o reaparece con respuestas neuronales, y (3) las neuronas pueden moverse en todas las direcciones, específicamente dentro y fuera de un plano focal o apareciendo en múltiples planos4, 6. El análisis manual requiere mucho tiempo y se vuelve poco práctico a medida que aumenta la duración de las grabaciones y el número de neuronas. Se han desarrollado varios programas de software para acelerar el proceso de análisis de imágenes de calcio. Anteriormente, el software se diseñaba en un contexto experimental limitado, lo que dificultaba que otros laboratorios lo adoptaran. Los esfuerzos recientes para cumplir con los estándares modernos para el intercambio de software han llevado al desarrollo de varias herramientas que pueden analizar consistentemente los datos de imágenes de calcio en diferentes grupos 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Sin embargo, la mayoría de estas herramientas requieren conocimientos de programación y/o dependen de software comercial. La falta de conocimientos de programación y los muros de pago de software disuaden a los investigadores de adoptar estos métodos. Además, muchas de estas herramientas se centran en corregir el movimiento x/y, aunque el movimiento en el eje z también necesita ser diagnosticado y corregido explícitamente6. Existe la necesidad de una herramienta computacional para analizar imágenes de calcio 3D que se centren en las neuronas que exhiben z-drift y aparecen en múltiples z-planos. Idealmente, esta herramienta debería usar software de código abierto y no requerir conocimientos de programación para permitir que otros laboratorios la adopten fácilmente.

Aquí, desarrollamos un nuevo complemento de ImageJ, TACI, para analizar datos de imágenes de calcio en 3D. Primero, el software cambia el nombre, si es necesario, y organiza los datos de imágenes de calcio 3D por posiciones z. Las células de interés se rastrean en cada posición z, y sus intensidades de fluorescencia son extraídas por TrackMate u otras herramientas computacionales. Luego se aplica TACI para examinar el movimiento en el eje z. Identifica el valor máximo de una pila z y lo utiliza para representar la intensidad de una celda en el punto de tiempo correspondiente. Este flujo de trabajo es adecuado para analizar imágenes 3D de calcio con movimiento en todas las direcciones y / o con neuronas superpuestas en la dirección lateral (x / y) pero que aparecen en diferentes posiciones z. Para validar este flujo de trabajo, se utilizaron conjuntos de datos de imágenes de calcio 3D de neuronas termosensibles larvales de moscas y neuronas de hongos en el cerebro. Cabe destacar que TACI es un complemento de código abierto de ImageJ y no requiere ningún conocimiento de programación.

Protocol

1. Imágenes de calcio Preparación de larvas de moscaNOTA: Las moscas y larvas se mantienen a 25 °C bajo un ciclo de luz:oscuridad de 12 h:12 h.Anestesiar las moscas conCO2. Clasificar 20-45 machos y 20-45 hembras en cada vial de mosca, y darles al menos 24 h a 48 h para recuperarse de la exposición alCO2 .NOTA: La exposición de las moscas alCO2 debe durar el menor tiempo posible. Para sincronizar la edad de las larvas, golpee sobr…

Representative Results

Flujo de trabajo del análisis de imágenes de calcio 3DEn este estudio, desarrollamos un nuevo complemento de ImageJ, TACI, y describimos un flujo de trabajo para rastrear la deriva z y analizar imágenes de calcio 3D que señalan las respuestas de las células individuales que aparecen en múltiples posiciones z (Figura 1). Esta herramienta tiene cuatro funciones: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT y MERGE. En …

Discussion

Este estudio desarrolló un nuevo complemento de ImageJ, TACI, y describió un flujo de trabajo que analiza las imágenes de calcio en 3D. Muchas herramientas actualmente disponibles se centran en corregir el movimiento x/y, aunque el movimiento en el eje z también necesita ser diagnosticado o corregido explícitamente6. Durante la adquisición de imágenes en un organismo vivo, el movimiento en el eje z es inevitable incluso cuando el organismo está inmovilizado, y algunos estímulos, como el c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Se utilizó un Zeiss LSM 880 en el Fralin Imaging Center para recopilar los datos de imágenes de calcio. Agradecemos a la Dra. Michelle L Olsen y Yuhang Pan por su ayuda con el software IMARIS. Agradecemos al Dr. Lenwood S. Heath por sus comentarios constructivos sobre el manuscrito y a Steven Giavasis por sus comentarios sobre el archivo README de GitHub. Este trabajo fue apoyado por NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) y NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) a L.N. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Materials

Blunt Fill Needel BD 303129
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific  10035-04-8 Fly food ingredient
Carbon dioxide Airgas UN1013 Size 200 High Pressure Steel Cylinder
CO2 bubbler kit Genesee 59-180
Confocal microscope LSM880 Zeiss 4109002107876000 An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2.
DAQami software Measurement Computing
Dextrose Genesee 62-113 Fly food ingredient
Drosophila Agar Genesee 66-111 Fly food ingredient
Ethanol Decon Labs, Inc. 64-17-5 Fly food ingredient
Fly line: Ir21a-Gal4 Dr. Paul Garrity lab A kind gift
Fly line: Ir21a-Gal80 Dr. Lina Ni lab
Fly line: Ir68a-Gal4 Dr. Aravinthan DT Samuel lab A kind gift
Fly line: Ir93a-Gal4 Dr. Paul Garrity lab A kind gift
Fly line: UAS-GCaMP6 Bloomington Drosophila Stock Center 42750
Flypad Genesee 59-114
General purpose forged brass regulator Gentec G152
Gibco PBS pH 7.4 (1x) Thermo Fisher Scientific 10010-031
Green Drosophila tubing Genesee 59-124
Heat transfer compound MG Chemicals 860-60G
Heatsink Digi-Key Electronics ATS2193-ND Resize to 12.9 x 5.5 cm
Illuminator AmScope LED-6W
Inactive Dry Yeast Genesee 62-108 Fly food ingredient
Incubator Pervical DR-41VL Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH.
Methyl-4-hydroxybenzoate Thermo Scientific 126965000 Fly food ingrediete
Micro cover glass VWR  48382-126 22 x 40 mm
Microscope slides Fisher Scientific  12-544-2 25 x 75 x 1.0 mm
Nail polish Kleancolor
Narrow Drosophila vials Genesee 32-113RL
Objective  Zeiss 420852-9871-000 LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27
Peltier cooling module TE Technology TE-127-1.0-0.8 30 x 30 mm
Plugs Genesee 49-102
Power Supply Circuit Specialists CSI1802X 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply
Princeton Artist Brush Nepture Princeton Artist Brush Co. Series 4750, size 2
Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate Thermo Scientific 033241-36 Fly food ingredient
Stage insert  Wienecke and Sinske 432339-9030-000
Stereo Microscope Olympus SZ61 Any stereo microscope works
T-Fitting Genesee 59-123
Thermocouple data acquisition device Measurement Computing USB-2001-TC Single channel
Thermocouple microprobe Physitemp IT-24P 
Yellow Cornmeal Genesee 62-101 Fly food ingredient
Z-axis piezo stage Wienecke and Sinske 432339-9000-000

References

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Cite This Article
Omelchenko, A. A., Bai, H., Hussain, S., Tyrrell, J. J., Klein, M., Ni, L. TACI: An ImageJ Plugin for 3D Calcium Imaging Analysis. J. Vis. Exp. (190), e64953, doi:10.3791/64953 (2022).

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