TACI: Un plugin de ImageJ para el análisis de imágenes de calcio 3D
Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) es un complemento de código abierto de ImageJ para el análisis de imágenes de calcio en 3D que examina el movimiento en el eje z e identifica el valor máximo de cada pila z para representar la intensidad de una celda en el punto de tiempo correspondiente. Puede separar neuronas que se superponen en la dirección lateral (x / y) pero en diferentes planos z.
Abstract
La investigación en neurociencia ha evolucionado para utilizar imágenes complejas y herramientas computacionales para extraer información completa de conjuntos de datos. La imagen de calcio es una técnica ampliamente utilizada que requiere un software sofisticado para obtener resultados confiables, pero muchos laboratorios luchan por adoptar métodos computacionales al actualizar los protocolos para cumplir con los estándares modernos. Las dificultades surgen debido a la falta de conocimientos de programación y paywalls para el software. Además, las células de interés muestran movimientos en todas las direcciones durante las imágenes de calcio. Se han desarrollado muchos enfoques para corregir el movimiento en la dirección lateral (x / y).
Este documento describe un flujo de trabajo utilizando un nuevo complemento de ImageJ, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), para examinar el movimiento en el eje z en imágenes de calcio 3D. Este software identifica el valor máximo de fluorescencia de todas las posiciones z en las que aparece una neurona y lo utiliza para representar la intensidad de la neurona en la posición t correspondiente. Por lo tanto, esta herramienta puede separar neuronas que se superponen en la dirección lateral (x / y) pero que aparecen en distintos planos z. Como complemento de ImageJ, TACI es una herramienta computacional de código abierto fácil de usar para el análisis de imágenes de calcio en 3D. Validamos este flujo de trabajo utilizando neuronas termosensibles larvales de mosca que mostraban movimientos en todas las direcciones durante la fluctuación de la temperatura y un conjunto de datos de imágenes de calcio en 3D adquiridos del cerebro de la mosca.
Introduction
El nivel de calcio intracelular es un marcador preciso de excitabilidad neuronal. La imagen de calcio mide los cambios en el calcio intracelular para comprender la actividad neuronal1. Los estudios en neurociencia han utilizado cada vez más este método debido al desarrollo de técnicas para medir la concentración intracelular de calcio, incluidos los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI), como GCaMP2,3, que pueden expresarse de forma no invasiva en conjuntos específicos de neuronas a través de enfoques genéticos. Los menores costos de los láseres y los componentes del microscopio también han aumentado el uso de imágenes de calcio4. Es importante destacar que las imágenes de calcio permiten registrar y estudiar neuronas individuales, así como grandes poblaciones de neuronas simultáneamente en animales que se mueven libremente5.
Sin embargo, el análisis de los datos de imágenes de calcio es desafiante porque (1) implica rastrear los cambios en la fluorescencia de las células individuales a lo largo del tiempo, (2) la señal de fluorescencia desaparece intermitentemente o reaparece con respuestas neuronales, y (3) las neuronas pueden moverse en todas las direcciones, específicamente dentro y fuera de un plano focal o apareciendo en múltiples planos4, 6. El análisis manual requiere mucho tiempo y se vuelve poco práctico a medida que aumenta la duración de las grabaciones y el número de neuronas. Se han desarrollado varios programas de software para acelerar el proceso de análisis de imágenes de calcio. Anteriormente, el software se diseñaba en un contexto experimental limitado, lo que dificultaba que otros laboratorios lo adoptaran. Los esfuerzos recientes para cumplir con los estándares modernos para el intercambio de software han llevado al desarrollo de varias herramientas que pueden analizar consistentemente los datos de imágenes de calcio en diferentes grupos 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Sin embargo, la mayoría de estas herramientas requieren conocimientos de programación y/o dependen de software comercial. La falta de conocimientos de programación y los muros de pago de software disuaden a los investigadores de adoptar estos métodos. Además, muchas de estas herramientas se centran en corregir el movimiento x/y, aunque el movimiento en el eje z también necesita ser diagnosticado y corregido explícitamente6. Existe la necesidad de una herramienta computacional para analizar imágenes de calcio 3D que se centren en las neuronas que exhiben z-drift y aparecen en múltiples z-planos. Idealmente, esta herramienta debería usar software de código abierto y no requerir conocimientos de programación para permitir que otros laboratorios la adopten fácilmente.
Aquí, desarrollamos un nuevo complemento de ImageJ, TACI, para analizar datos de imágenes de calcio en 3D. Primero, el software cambia el nombre, si es necesario, y organiza los datos de imágenes de calcio 3D por posiciones z. Las células de interés se rastrean en cada posición z, y sus intensidades de fluorescencia son extraídas por TrackMate u otras herramientas computacionales. Luego se aplica TACI para examinar el movimiento en el eje z. Identifica el valor máximo de una pila z y lo utiliza para representar la intensidad de una celda en el punto de tiempo correspondiente. Este flujo de trabajo es adecuado para analizar imágenes 3D de calcio con movimiento en todas las direcciones y / o con neuronas superpuestas en la dirección lateral (x / y) pero que aparecen en diferentes posiciones z. Para validar este flujo de trabajo, se utilizaron conjuntos de datos de imágenes de calcio 3D de neuronas termosensibles larvales de moscas y neuronas de hongos en el cerebro. Cabe destacar que TACI es un complemento de código abierto de ImageJ y no requiere ningún conocimiento de programación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudio desarrolló un nuevo complemento de ImageJ, TACI, y describió un flujo de trabajo que analiza las imágenes de calcio en 3D. Muchas herramientas actualmente disponibles se centran en corregir el movimiento x/y, aunque el movimiento en el eje z también necesita ser diagnosticado o corregido explícitamente6. Durante la adquisición de imágenes en un organismo vivo, el movimiento en el eje z es inevitable incluso cuando el organismo está inmovilizado, y algunos estímulos, como el c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Se utilizó un Zeiss LSM 880 en el Fralin Imaging Center para recopilar los datos de imágenes de calcio. Agradecemos a la Dra. Michelle L Olsen y Yuhang Pan por su ayuda con el software IMARIS. Agradecemos al Dr. Lenwood S. Heath por sus comentarios constructivos sobre el manuscrito y a Steven Giavasis por sus comentarios sobre el archivo README de GitHub. Este trabajo fue apoyado por NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) y NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) a L.N. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
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