TACI: плагин ImageJ для 3D-анализа кальциевых изображений
Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) — это плагин ImageJ с открытым исходным кодом для 3D-анализа кальциевых изображений, который исследует движение по оси Z и определяет максимальное значение каждого z-стека для представления интенсивности ячейки в соответствующий момент времени. Он может разделять нейроны, перекрывающиеся в латеральном (x/y) направлении, но в разных z-плоскостях.
Abstract
Исследования в области нейробиологии эволюционировали, чтобы использовать сложные инструменты визуализации и вычислений для извлечения исчерпывающей информации из наборов данных. Кальциевая визуализация является широко используемым методом, который требует сложного программного обеспечения для получения надежных результатов, но многие лаборатории изо всех сил пытаются использовать вычислительные методы при обновлении протоколов в соответствии с современными стандартами. Трудности возникают из-за отсутствия знаний в области программирования и платного доступа к программному обеспечению. Кроме того, интересующие клетки демонстрируют движения во всех направлениях во время визуализации кальция. Было разработано множество подходов для коррекции движения в боковом (x/y) направлении.
В этой статье описывается рабочий процесс с использованием нового плагина ImageJ, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), для изучения движения по оси z в 3D-визуализации кальция. Это программное обеспечение определяет максимальное значение флуоресценции из всех z-позиций, в которых появляется нейрон, и использует его для представления интенсивности нейрона в соответствующем t-положении. Следовательно, этот инструмент может разделять нейроны, перекрывающиеся в латеральном направлении (x/y), но появляющиеся на разных z-плоскостях. Как плагин ImageJ, TACI представляет собой удобный вычислительный инструмент с открытым исходным кодом для 3D-анализа кальциевых изображений. Мы проверили этот рабочий процесс, используя термочувствительные нейроны личинок мух, которые отображали движения во всех направлениях во время колебаний температуры, и набор данных 3D-визуализации кальция, полученный из мозга мухи.
Introduction
Уровень внутриклеточного кальция является точным маркером возбудимости нейронов. Визуализация кальция измеряет изменения внутриклеточного кальция, чтобы понять активность нейронов1. Исследования в области нейробиологии все чаще используют этот метод в связи с разработкой методов измерения внутриклеточной концентрации кальция, включая генетически кодируемые индикаторы кальция (GECI), такие как GCaMP2,3, которые могут быть неинвазивно экспрессированы в определенных наборах нейронов с помощью генетических подходов. Более низкие затраты на лазеры и компоненты микроскопов также увеличили использование кальциевой визуализации4. Важно отметить, что визуализация кальция позволяет одновременно регистрировать и изучать отдельные нейроны, а также большие популяции нейронов у свободно перемещающихся животных5.
Тем не менее, анализ данных визуализации кальция является сложной задачей, потому что (1) он включает в себя отслеживание изменений флуоресценции отдельных клеток с течением времени, (2) сигнал флуоресценции периодически исчезает или снова появляется с реакциями нейронов, и (3) нейроны могут двигаться во всех направлениях, особенно в фокальной плоскости и из нее или появляться в нескольких плоскостях4, 6. Ручной анализ отнимает много времени и становится непрактичным по мере увеличения длины записей и количества нейронов. Для ускорения процесса анализа кальциевых изображений были разработаны различные программы. Ранее программное обеспечение разрабатывалось в ограниченном экспериментальном контексте, что затрудняло его внедрение другими лабораториями. Недавние усилия по соблюдению современных стандартов совместного использования программного обеспечения привели к разработке нескольких инструментов, которые могут последовательно анализировать данные визуализации кальция в разных группах 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Однако большинство из этих инструментов требуют знаний в области программирования и/или зависят от коммерческого программного обеспечения. Отсутствие знаний в области программирования и платный доступ к программному обеспечению удерживают исследователей от принятия этих методов. Более того, многие из этих инструментов сосредоточены на коррекции движения x/y, хотя движение по оси z также нуждается в явной диагностике и коррекции6. Существует потребность в вычислительном инструменте для анализа 3D-изображений кальция, который фокусируется на нейронах, демонстрирующих z-дрейф и появляющихся на нескольких z-плоскостях. В идеале этот инструмент должен использовать программное обеспечение с открытым исходным кодом и не требовать знаний в области программирования, чтобы другие лаборатории могли легко его принять.
Здесь мы разработали новый плагин ImageJ, TACI, для анализа данных 3D-визуализации кальция. Во-первых, программное обеспечение переименовывает, если это необходимо, и упорядочивает данные 3D-визуализации кальция по z-позициям. Интересующие ячейки отслеживаются в каждой z-позиции, а их интенсивность флуоресценции извлекается с помощью TrackMate или других вычислительных инструментов. Затем применяется TACI для изучения движения по оси z. Он определяет максимальное значение z-стека и использует его для представления интенсивности ячейки в соответствующий момент времени. Этот рабочий процесс подходит для анализа 3D-визуализации кальция с движением во всех направлениях и/или с нейронами, перекрывающимися в боковом (x/y) направлении, но появляющимися в разных z-положениях. Для проверки этого рабочего процесса были использованы наборы данных 3D-визуализации кальция из термочувствительных нейронов личинок мух и грибовидных нейронов в головном мозге. Следует отметить, что TACI является плагином ImageJ с открытым исходным кодом и не требует каких-либо знаний в области программирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании был разработан новый плагин ImageJ, TACI, и описан рабочий процесс, анализирующий 3D-визуализацию кальция. Многие доступные в настоящее время инструменты сосредоточены на коррекции движения x/y, хотя движение по оси z также нуждается в явной диагностике или коррекции<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Zeiss LSM 880 в Центре визуализации Фралина использовался для сбора данных визуализации кальция. Мы выражаем благодарность доктору Мишель Л. Олсен и Юхану Пану за помощь в разработке программного обеспечения IMARIS. Выражаем благодарность д-ру Ленвуду С. Хиту (Lenwood S. Heath) за конструктивные комментарии к рукописи и Стивену Джавасису (Steven Giavasis) за комментарии к файлу сведений GitHub. Эта работа была поддержана NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) и NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) в L.N. Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Materials
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
References
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y., et al. jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
- Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. Calcium imaging analysis – How far have we come. F1000Research. 10, 258 (2021).
- Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).
- Stringer, C., Pachitariu, M. Computational processing of neural recordings from calcium imaging data. Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517 (2017).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. bioRxiv. , (2021).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Scientific Reports. 10, 7153 (2020).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Eglen, S. J., et al. Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience. Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).
- Pachitariu, M., et al. Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , (2017).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432 (2021).
- Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data. Nature Communications. 12, 6569 (2021).
- Moein, M., et al. CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool. Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Neugornet, A., O’Donovan, B., Ortinski, P. I. Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data. Frontiers in Neuroscience. 15, 620869 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Fazeli, E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Research. 9, 1279 (2020).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ni, L., et al. The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Omelchenko, A. A., et al. Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae. Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nature Communications. 9 (1), 4252 (2018).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis. Science Advances. 7 (35), (2021).
- Klein, M., et al. Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).
