TACI: Um plugin ImageJ para análise de imagem de cálcio 3D
Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) é um plugin ImageJ de código aberto para análise de imagem de cálcio 3D que examina o movimento no eixo z e identifica o valor máximo de cada z-stack para representar a intensidade de uma célula no ponto de tempo correspondente. Pode separar neurônios sobrepostos na direção lateral (x / y), mas em diferentes planos z.
Abstract
A pesquisa em neurociência evoluiu para usar imagens complexas e ferramentas computacionais para extrair informações abrangentes de conjuntos de dados. A imagem de cálcio é uma técnica amplamente utilizada que requer software sofisticado para obter resultados confiáveis, mas muitos laboratórios lutam para adotar métodos computacionais ao atualizar protocolos para atender aos padrões modernos. As dificuldades surgem devido à falta de conhecimento de programação e paywalls para software. Além disso, as células de interesse exibem movimentos em todas as direções durante a imagem de cálcio. Muitas abordagens foram desenvolvidas para corrigir o movimento na direção lateral (x/y).
Este artigo descreve um fluxo de trabalho usando um novo plug-in ImageJ, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), para examinar o movimento no eixo z em imagens de cálcio 3D. Este software identifica o valor máximo de fluorescência de todas as posições z em que um neurônio aparece e o usa para representar a intensidade do neurônio na posição t correspondente. Portanto, esta ferramenta pode separar neurônios sobrepostos na direção lateral (x / y), mas aparecendo em planos z distintos. Como um plugin ImageJ, o TACI é uma ferramenta computacional de código aberto e fácil de usar para análise de imagens de cálcio 3D. Validamos esse fluxo de trabalho usando neurônios termossensíveis de larvas de moscas que exibiam movimentos em todas as direções durante a flutuação da temperatura e um conjunto de dados de imagem de cálcio 3D adquirido do cérebro da mosca.
Introduction
O nível de cálcio intracelular é um marcador preciso de excitabilidade neuronal. A imagem de cálcio mede as alterações no cálcio intracelular para entender a atividade neuronal1. Estudos em neurociência têm utilizado cada vez mais esse método devido ao desenvolvimento de técnicas para medir a concentração intracelular de cálcio, incluindo indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs), como o GCaMP2,3, que podem ser expressos de forma não invasiva em conjuntos específicos de neurônios por meio de abordagens genéticas. Os menores custos de lasers e componentes do microscópio também aumentaram o uso de imagens de cálcio4. É importante ressaltar que a imagem de cálcio permite registrar e estudar neurônios únicos, bem como grandes populações de neurônios simultaneamente em animais em movimento livre5.
No entanto, a análise de dados de imagem de cálcio é desafiadora porque (1) envolve o rastreamento das mudanças na fluorescência de células individuais ao longo do tempo, (2) o sinal de fluorescência desaparece intermitentemente ou reaparece com respostas neuronais e (3) os neurônios podem se mover em todas as direções, especificamente dentro e fora de um plano focal ou aparecendo em vários planos4, 6. A análise manual é demorada e torna-se impraticável à medida que a duração das gravações e o número de neurônios aumentam. Vários programas de software foram desenvolvidos para acelerar o processo de análise de imagens de cálcio. Anteriormente, o software era projetado em um contexto experimental limitado, dificultando a adoção por outros laboratórios. Esforços recentes para atender aos padrões modernos de compartilhamento de software levaram ao desenvolvimento de várias ferramentas que podem analisar consistentemente dados de imagem de cálcio em diferentes grupos 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . No entanto, a maioria dessas ferramentas requer conhecimento de programação e / ou depende de software comercial. A falta de conhecimento de programação e paywalls de software dissuadem os pesquisadores de adotar esses métodos. Além disso, muitas dessas ferramentas se concentram na correção do movimento x/y, embora o movimento no eixo z também precise ser explicitamente diagnosticado e corrigido6. Há uma necessidade de uma ferramenta computacional para analisar imagens de cálcio 3D que se concentram em neurônios que exibem deriva z e aparecem em vários planos z. Idealmente, essa ferramenta deve usar software de código aberto e não exigir conhecimento de programação para permitir que outros laboratórios a adotem prontamente.
Aqui, desenvolvemos um novo plugin ImageJ, TACI, para analisar dados de imagem de cálcio 3D. Primeiro, o software renomeia, se necessário, e organiza os dados de imagem de cálcio 3D por posições z. As células de interesse são rastreadas em cada posição z, e suas intensidades de fluorescência são extraídas pelo TrackMate ou outras ferramentas computacionais. O TACI é então aplicado para examinar o movimento no eixo z. Ele identifica o valor máximo de uma pilha z e o usa para representar a intensidade de uma célula no ponto de tempo correspondente. Este fluxo de trabalho é adequado para analisar imagens de cálcio 3D com movimento em todas as direções e / ou com neurônios sobrepostos na direção lateral (x / y), mas aparecendo em diferentes posições z. Para validar esse fluxo de trabalho, foram usados conjuntos de dados de imagem de cálcio 3D de neurônios termossensíveis de larvas de moscas e neurônios de cogumelos no cérebro. De notar, TACI é um plugin ImageJ de código aberto e não requer nenhum conhecimento de programação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudo desenvolveu um novo plugin ImageJ, TACI, e descreveu um fluxo de trabalho analisando imagens de cálcio 3D. Muitas ferramentas atualmente disponíveis se concentram na correção do movimento x/y, embora o movimento no eixo z também precise ser explicitamente diagnosticado ou corrigido6. Durante a aquisição de imagens em um organismo vivo, o movimento no eixo z é inevitável mesmo quando o organismo está imobilizado, e alguns estímulos, como a mudança de temperatura, muitas veze…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Um Zeiss LSM 880 no Fralin Imaging Center foi utilizado para coletar os dados de imagem de cálcio. Agradecemos à Dra. Michelle L Olsen e Yuhang Pan por sua assistência com o software IMARIS. Agradecemos ao Dr. Lenwood S. Heath por comentários construtivos sobre o manuscrito e Steven Giavasis por comentários sobre o arquivo README do GitHub. Este trabalho foi apoiado pelo NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) e NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) para L.N. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.
Materials
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
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