TACI: 3D Kalsiyum Görüntüleme Analizi için Bir ImageJ Eklentisi
Summary
TrackMate Kalsiyum Görüntüleme Analizi (TACI), z eksenindeki hareketi inceleyen ve bir hücrenin yoğunluğunu karşılık gelen zaman noktasında temsil etmek için her z-yığınının maksimum değerini tanımlayan 3D kalsiyum görüntüleme analizi için açık kaynaklı bir ImageJ eklentisidir. Yanal (x / y) yönde üst üste binen nöronları, ancak farklı z-düzlemlerinde ayırabilir.
Abstract
Sinirbilimdeki araştırmalar, veri kümelerinden kapsamlı bilgiler çıkarmak için karmaşık görüntüleme ve hesaplama araçlarını kullanacak şekilde gelişmiştir. Kalsiyum görüntüleme, güvenilir sonuçlar elde etmek için sofistike yazılımlar gerektiren yaygın olarak kullanılan bir tekniktir, ancak birçok laboratuvar, protokolleri modern standartları karşılayacak şekilde güncellerken hesaplama yöntemlerini benimsemekte zorlanmaktadır. Programlama bilgisi eksikliği ve yazılım için ödeme duvarları nedeniyle zorluklar ortaya çıkmaktadır. Ek olarak, ilgilenilen hücreler kalsiyum görüntüleme sırasında her yönde hareketler gösterir. Hareketi lateral (x/y) yönde düzeltmek için birçok yaklaşım geliştirilmiştir.
Bu makalede, 3D kalsiyum görüntülemede z eksenindeki hareketi incelemek için yeni bir ImageJ eklentisi olan TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) kullanılarak gerçekleştirilen bir iş akışı açıklanmaktadır. Bu yazılım, bir nöronun göründüğü tüm z-pozisyonlarından maksimum floresan değerini tanımlar ve nöronun yoğunluğunu karşılık gelen t-pozisyonunda temsil etmek için kullanır. Bu nedenle, bu araç yanal (x / y) yönde üst üste binen, ancak farklı z-düzlemlerinde görünen nöronları ayırabilir. Bir ImageJ eklentisi olarak TACI, 3D kalsiyum görüntüleme analizi için kullanıcı dostu, açık kaynaklı bir hesaplama aracıdır. Bu iş akışını, sıcaklık dalgalanması sırasında her yöne hareketleri gösteren sinek larva ısıya duyarlı nöronları ve sinek beyninden elde edilen bir 3D kalsiyum görüntüleme veri kümesini kullanarak doğruladık.
Introduction
Hücre içi kalsiyum seviyesi, nöronal uyarılabilirliğin kesin bir belirtecidir. Kalsiyum görüntüleme, nöronal aktiviteyi anlamak için hücre içi kalsiyumdaki değişiklikleri ölçer1. Nörobilimdeki çalışmalar, genetik yaklaşımlar yoluyla belirli nöron kümelerinde noninvaziv olarak ifade edilebilen GCaMP 2,3 gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI’ler) de dahil olmak üzere hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu ölçmek için tekniklerin geliştirilmesi nedeniyle bu yöntemi giderek daha fazla kullanmıştır. Lazerlerin ve mikroskop bileşenlerinin düşük maliyetleri de kalsiyum görüntüleme kullanımını arttırmıştır4. Daha da önemlisi, kalsiyum görüntüleme, serbestçe hareket eden hayvanlarda aynı anda tek nöronların yanı sıra büyük nöron popülasyonlarının kaydedilmesine ve incelenmesine izin verir5.
Bununla birlikte, kalsiyum görüntüleme verilerinin analizi zordur, çünkü (1) zaman içinde bireysel hücrelerin floresansındaki değişiklikleri izlemeyi içerir, (2) floresan sinyali nöronal yanıtlarla aralıklı olarak kaybolur veya yeniden ortaya çıkar ve (3) nöronlar her yönde, özellikle bir odak düzleminin içinde ve dışında hareket edebilir veya birden fazla düzlemde görünebilir4, 6. Manuel analiz zaman alıcıdır ve kayıtların uzunluğu ve nöronların sayısı arttıkça pratik hale gelir. Kalsiyum görüntüleme analiz sürecini hızlandırmak için çeşitli yazılım programları geliştirilmiştir. Önceden, yazılım sınırlı bir deneysel bağlamda tasarlandı ve diğer laboratuvarların onu benimsemesini zorlaştırdı. Yazılım paylaşımı için modern standartları karşılamaya yönelik son çabalar, farklı gruplardaki kalsiyum görüntüleme verilerini tutarlı bir şekilde analiz edebilen çeşitli araçların geliştirilmesine yol açmıştır 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Bununla birlikte, bu araçların çoğu programlama bilgisi gerektirir ve / veya ticari yazılıma bağlıdır. Programlama bilgisi ve yazılım ödeme duvarlarının eksikliği, araştırmacıları bu yöntemleri benimsemekten caydırmaktadır. Dahası, bu araçların birçoğu x / y hareketini düzeltmeye odaklanır, ancak z eksenindeki hareketin de açıkça teşhis edilmesi ve düzeltilmesi gerekir6. Z-sürüklenmesi sergileyen ve çoklu z-düzlemlerinde görünen nöronlara odaklanan 3D kalsiyum görüntülemeyi analiz etmek için hesaplamalı bir araca ihtiyaç vardır. İdeal olarak, bu araç açık kaynaklı yazılım kullanmalı ve diğer laboratuvarların kolayca benimsemesine izin vermek için programlama bilgisi gerektirmemelidir.
Burada, 3D kalsiyum görüntüleme verilerini analiz etmek için yeni bir ImageJ eklentisi olan TACI’yi geliştirdik. İlk olarak, yazılım gerekirse yeniden adlandırır ve 3D kalsiyum görüntüleme verilerini z-konumlarına göre düzenler. İlgilenilen hücreler her z-pozisyonunda izlenir ve floresan yoğunlukları TrackMate veya diğer hesaplama araçları tarafından çıkarılır. TACI daha sonra z eksenindeki hareketi incelemek için uygulanır. Bir z-yığınının maksimum değerini tanımlar ve karşılık gelen zaman noktasında bir hücrenin yoğunluğunu temsil etmek için kullanır. Bu iş akışı, 3D kalsiyum görüntülemeyi her yöne hareket ederek ve / veya yanal (x / y) yönde üst üste binen ancak farklı z konumlarında görünen nöronlarla analiz etmek için uygundur. Bu iş akışını doğrulamak için, sinek larva ısıl duyarlı nöronlarından ve beyindeki mantar nöronlarından 3D kalsiyum görüntüleme veri kümeleri kullanılmıştır. Not olarak, TACI açık kaynaklı bir ImageJ eklentisidir ve herhangi bir programlama bilgisi gerektirmez.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma yeni bir ImageJ eklentisi olan TACI’yi geliştirdi ve 3D kalsiyum görüntülemeyi analiz eden bir iş akışını tanımladı. Şu anda mevcut olan birçok araç, x / y hareketini düzeltmeye odaklanmaktadır, ancak z eksenindeki hareketin de açıkça teşhis edilmesi veya düzeltilmesi gerekir6. Canlı bir organizmada görüntü elde etme sırasında, organizma hareketsiz hale getirildiğinde bile z ekseni üzerindeki hareket kaçınılmazdır ve sıcaklık değişimi gibi bazı u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kalsiyum görüntüleme verilerini toplamak için Fralin Görüntüleme Merkezi’ndeki bir Zeiss LSM 880 kullanıldı. Dr. Michelle L Olsen ve Yuhang Pan’a IMARIS yazılımındaki yardımları için teşekkür ederiz. Dr. Lenwood S. Heath’e el yazması hakkındaki yapıcı yorumları için ve Steven Giavasis’e GitHub README dosyasındaki yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) ve NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) tarafından L.N.’ye desteklenmiştir. Fon verenlerin çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
Materials
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
References
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y., et al. jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
- Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. Calcium imaging analysis – How far have we come. F1000Research. 10, 258 (2021).
- Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).
- Stringer, C., Pachitariu, M. Computational processing of neural recordings from calcium imaging data. Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517 (2017).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. bioRxiv. , (2021).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Scientific Reports. 10, 7153 (2020).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Eglen, S. J., et al. Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience. Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).
- Pachitariu, M., et al. Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , (2017).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432 (2021).
- Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data. Nature Communications. 12, 6569 (2021).
- Moein, M., et al. CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool. Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Neugornet, A., O’Donovan, B., Ortinski, P. I. Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data. Frontiers in Neuroscience. 15, 620869 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Fazeli, E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Research. 9, 1279 (2020).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ni, L., et al. The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Omelchenko, A. A., et al. Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae. Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nature Communications. 9 (1), 4252 (2018).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis. Science Advances. 7 (35), (2021).
- Klein, M., et al. Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).
