TACI: un plugin ImageJ per l'analisi 3D dell'imaging del calcio
Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) è un plugin ImageJ open source per l’analisi 3D dell’imaging del calcio che esamina il movimento sull’asse z e identifica il valore massimo di ogni z-stack per rappresentare l’intensità di una cella nel punto temporale corrispondente. Può separare i neuroni che si sovrappongono nella direzione laterale (x / y) ma su diversi piani z.
Abstract
La ricerca nelle neuroscienze si è evoluta per utilizzare complessi strumenti di imaging e computazionali per estrarre informazioni complete dai set di dati. L’imaging del calcio è una tecnica ampiamente utilizzata che richiede un software sofisticato per ottenere risultati affidabili, ma molti laboratori faticano ad adottare metodi computazionali quando aggiornano i protocolli per soddisfare gli standard moderni. Le difficoltà sorgono a causa della mancanza di conoscenze di programmazione e paywall per il software. Inoltre, le cellule di interesse mostrano movimenti in tutte le direzioni durante l’imaging del calcio. Sono stati sviluppati molti approcci per correggere il movimento nella direzione laterale (x/y).
Questo documento descrive un flusso di lavoro che utilizza un nuovo plug-in ImageJ, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), per esaminare il movimento sull’asse z nell’imaging 3D del calcio. Questo software identifica il valore massimo di fluorescenza da tutte le posizioni z in cui appare un neurone e lo utilizza per rappresentare l’intensità del neurone nella posizione t corrispondente. Pertanto, questo strumento può separare i neuroni che si sovrappongono nella direzione laterale (x / y) ma appaiono su piani z distinti. Come plug-in ImageJ, TACI è uno strumento computazionale open source e facile da usare per l’analisi 3D dell’imaging del calcio. Abbiamo convalidato questo flusso di lavoro utilizzando neuroni termosensibili larvali di mosca che mostravano movimenti in tutte le direzioni durante la fluttuazione della temperatura e un set di dati di imaging del calcio 3D acquisito dal cervello del moscerino.
Introduction
Il livello di calcio intracellulare è un marcatore preciso di eccitabilità neuronale. L’imaging del calcio misura i cambiamenti nel calcio intracellulare per comprendere l’attività neuronale1. Gli studi nelle neuroscienze hanno sempre più utilizzato questo metodo a causa dello sviluppo di tecniche per misurare la concentrazione intracellulare di calcio, compresi gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI), come GCaMP2,3, che possono essere espressi in modo non invasivo in specifici gruppi di neuroni attraverso approcci genetici. I minori costi dei laser e dei componenti del microscopio hanno anche aumentato l’uso dell’imaging del calcio4. È importante sottolineare che l’imaging del calcio consente di registrare e studiare contemporaneamente singoli neuroni e grandi popolazioni di neuroni in animali che si muovono liberamente5.
Tuttavia, l’analisi dei dati di imaging del calcio è impegnativa perché (1) comporta il monitoraggio dei cambiamenti nella fluorescenza delle singole cellule nel tempo, (2) il segnale di fluorescenza scompare o riappare in modo intermittente con risposte neuronali e (3) i neuroni possono muoversi in tutte le direzioni, in particolare dentro e fuori da un piano focale o apparire su più piani4, 6. L’analisi manuale richiede molto tempo e diventa poco pratica con l’aumentare della lunghezza delle registrazioni e del numero di neuroni. Sono stati sviluppati vari programmi software per accelerare il processo di analisi dell’imaging del calcio. In precedenza, il software era stato progettato in un contesto sperimentale limitato, rendendo difficile per altri laboratori adottarlo. I recenti sforzi per soddisfare i moderni standard per la condivisione del software hanno portato allo sviluppo di diversi strumenti in grado di analizzare costantemente i dati di imaging del calcio in diversi gruppi 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Tuttavia, la maggior parte di questi strumenti richiede conoscenze di programmazione e / o dipende da software commerciali. La mancanza di conoscenze di programmazione e paywall software scoraggiano i ricercatori dall’adottare questi metodi. Inoltre, molti di questi strumenti si concentrano sulla correzione del movimento x/y, sebbene anche il movimento sull’asse z debba essere esplicitamente diagnosticato e corretto6. C’è bisogno di uno strumento computazionale per analizzare l’imaging 3D del calcio che si concentra sui neuroni che mostrano z-drift e appaiono su più piani z. Idealmente, questo strumento dovrebbe utilizzare software open source e non richiedere conoscenze di programmazione per consentire ad altri laboratori di adottarlo prontamente.
Qui, abbiamo sviluppato un nuovo plug-in ImageJ, TACI, per analizzare i dati di imaging 3D del calcio. Innanzitutto, il software rinomina, se necessario, e organizza i dati di imaging del calcio 3D per posizioni z. Le celle di interesse sono tracciate in ogni posizione z e le loro intensità di fluorescenza sono estratte da TrackMate o altri strumenti computazionali. TACI viene quindi applicato per esaminare il movimento sull’asse z. Identifica il valore massimo di uno z-stack e lo utilizza per rappresentare l’intensità di una cella nel punto temporale corrispondente. Questo flusso di lavoro è adatto all’analisi dell’imaging 3D del calcio con movimento in tutte le direzioni e / o con neuroni sovrapposti nella direzione laterale (x / y) ma che appaiono in diverse posizioni z. Per convalidare questo flusso di lavoro, sono stati utilizzati set di dati di imaging del calcio 3D da neuroni termosensibili larvali di mosca e neuroni di funghi nel cervello. Da notare che TACI è un plugin ImageJ open source e non richiede alcuna conoscenza di programmazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio ha sviluppato un nuovo plug-in ImageJ, TACI, e ha descritto un flusso di lavoro che analizza l’imaging 3D del calcio. Molti strumenti attualmente disponibili si concentrano sulla correzione del movimento x/y, sebbene anche il movimento sull’asse z debba essere esplicitamente diagnosticato o corretto6. Durante l’acquisizione di immagini in un organismo vivo, il movimento sull’asse z è inevitabile anche quando l’organismo è immobilizzato e alcuni stimoli, come il cambiamento di tempe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Uno Zeiss LSM 880 nel Fralin Imaging Center è stato utilizzato per raccogliere i dati di imaging del calcio. Ringraziamo la dottoressa Michelle L Olsen e Yuhang Pan per la loro assistenza con il software IMARIS. Riconosciamo il Dr. Lenwood S. Heath per i commenti costruttivi sul manoscritto e Steven Giavasis per i commenti sul file README di GitHub. Questo lavoro è stato supportato da NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) e NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) a L.N. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
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