TACI: Een ImageJ Plugin voor 3D Calcium Imaging Analyse
Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) is een open-source ImageJ-plug-in voor 3D-calciumbeeldvormingsanalyse die beweging op de z-as onderzoekt en de maximale waarde van elke z-stack identificeert om de intensiteit van een cel op het overeenkomstige tijdstip weer te geven. Het kan neuronen scheiden die elkaar overlappen in de laterale (x / y) richting, maar op verschillende z-vlakken.
Abstract
Onderzoek in de neurowetenschappen is geëvolueerd om complexe beeldvormings- en computationele hulpmiddelen te gebruiken om uitgebreide informatie uit datasets te extraheren. Calciumbeeldvorming is een veelgebruikte techniek die geavanceerde software vereist om betrouwbare resultaten te verkrijgen, maar veel laboratoria hebben moeite om computationele methoden toe te passen bij het bijwerken van protocollen om aan moderne normen te voldoen. Problemen ontstaan door een gebrek aan programmeerkennis en paywalls voor software. Bovendien vertonen interessante cellen bewegingen in alle richtingen tijdens calciumbeeldvorming. Er zijn veel benaderingen ontwikkeld om de beweging in de laterale (x/y) richting te corrigeren.
Dit artikel beschrijft een workflow met behulp van een nieuwe ImageJ-plug-in, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), om beweging op de z-as in 3D-calciumbeeldvorming te onderzoeken. Deze software identificeert de maximale fluorescentiewaarde van alle z-posities waarin een neuron verschijnt en gebruikt deze om de intensiteit van het neuron op de overeenkomstige t-positie weer te geven. Daarom kan deze tool neuronen scheiden die elkaar overlappen in de laterale (x / y) richting, maar verschijnen op verschillende z-vlakken. Als ImageJ-plug-in is TACI een gebruiksvriendelijke, open-source computationele tool voor 3D-calciumbeeldvormingsanalyse. We hebben deze workflow gevalideerd met behulp van thermosensitieve neuronen van vlieglarven die bewegingen in alle richtingen vertoonden tijdens temperatuurschommelingen en een 3D-calciumbeeldvormingsdataset verkregen van het vliegenbrein.
Introduction
Het niveau van intracellulair calcium is een precieze marker van neuronale prikkelbaarheid. Calciumbeeldvorming meet de veranderingen in intracellulair calcium om neuronale activiteitte begrijpen 1. Studies in de neurowetenschappen hebben deze methode in toenemende mate gebruikt vanwege de ontwikkeling van technieken voor het meten van intracellulaire calciumconcentratie, waaronder genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECIs), zoals GCaMP2,3, die niet-invasief kunnen worden uitgedrukt in specifieke sets neuronen via genetische benaderingen. De lagere kosten van lasers en microscoopcomponenten hebben ook het gebruik van calciumbeeldvorming4 verhoogd. Belangrijk is dat calciumbeeldvorming het mogelijk maakt om afzonderlijke neuronen en grote neuronpopulaties tegelijkertijd te registreren en te bestuderen in vrij bewegende dieren5.
Niettemin is de analyse van calciumbeeldvormingsgegevens een uitdaging omdat (1) het gaat om het volgen van de veranderingen in fluorescentie van individuele cellen in de loop van de tijd, (2) het fluorescentiesignaal met tussenpozen verdwijnt of opnieuw verschijnt met neuronale reacties, en (3) de neuronen in alle richtingen kunnen bewegen, met name in en uit een brandpuntsvlak of verschijnen op meerdere vlakken4, 6. Handmatige analyse is tijdrovend en wordt onpraktisch naarmate de lengte van opnames en het aantal neuronen toeneemt. Er zijn verschillende softwareprogramma’s ontwikkeld om het proces van het analyseren van calciumbeeldvorming te versnellen. Voorheen werd software ontworpen in een beperkte experimentele context, waardoor het voor andere laboratoria moeilijk was om het te adopteren. Recente inspanningen om te voldoen aan moderne normen voor het delen van software hebben geleid tot de ontwikkeling van verschillende tools die consistent calciumbeeldvormingsgegevens kunnen analyseren in verschillende groepen 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . De meeste van deze tools vereisen echter programmeerkennis en/of zijn afhankelijk van commerciële software. Een gebrek aan programmeerkennis en software paywalls weerhouden onderzoekers ervan om deze methoden toe te passen. Bovendien richten veel van deze tools zich op het corrigeren van de x/y-beweging, hoewel beweging op de z-as ook expliciet moet worden gediagnosticeerd en gecorrigeerd6. Er is behoefte aan een computationeel hulpmiddel om 3D-calciumbeeldvorming te analyseren die zich richt op neuronen die z-drift vertonen en op meerdere z-vlakken verschijnen. Idealiter zou deze tool open-source software moeten gebruiken en geen programmeerkennis vereisen om andere laboratoria in staat te stellen het gemakkelijk te adopteren.
Hier hebben we een nieuwe ImageJ-plug-in, TACI, ontwikkeld om 3D-calciumbeeldvormingsgegevens te analyseren. Eerst hernoemt de software, indien nodig, en organiseert de 3D-calciumbeeldvormingsgegevens op z-posities. De cellen van belang worden gevolgd in elke z-positie en hun fluorescentie-intensiteiten worden geëxtraheerd door TrackMate of andere computationele hulpmiddelen. TACI wordt vervolgens toegepast om de beweging op de z-as te onderzoeken. Het identificeert de maximale waarde van een z-stack en gebruikt deze om de intensiteit van een cel op het overeenkomstige tijdstip weer te geven. Deze workflow is geschikt voor het analyseren van 3D-calciumbeeldvorming met beweging in alle richtingen en / of met neuronen die elkaar overlappen in de laterale (x / y) richting, maar in verschillende z-posities verschijnen. Om deze workflow te valideren, werden 3D-calciumbeeldvormingsdatasets van thermosensitieve neuronen van vliegenlarven en paddenstoelneuronen in de hersenen gebruikt. Van belang is dat TACI een open-source ImageJ-plug-in is en geen programmeerkennis vereist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze studie ontwikkelde een nieuwe ImageJ-plug-in, TACI, en beschreef een workflow die 3D-calciumbeeldvorming analyseert. Veel momenteel beschikbare tools richten zich op het corrigeren van de x/y-beweging, hoewel beweging op de z-as ook expliciet moet worden gediagnosticeerd of gecorrigeerd6. Tijdens beeldacquisitie in een levend organisme is beweging op de z-as onvermijdelijk, zelfs wanneer het organisme is geïmmobiliseerd, en sommige stimuli, zoals temperatuurverandering, veroorzaken vaak aanz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Een Zeiss LSM 880 in het Fralin Imaging Center werd gebruikt om de calciumbeeldvormingsgegevens te verzamelen. We erkennen Dr. Michelle L Olsen en Yuhang Pan voor hun hulp met de IMARIS-software. We erkennen Dr. Lenwood S. Heath voor constructieve opmerkingen over het manuscript en Steven Giavasis voor opmerkingen over het GitHub README-bestand. Dit werk werd ondersteund door NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) en NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) aan L.N. De financiers hadden geen rol in het studieontwerp, de gegevensverzameling en -analyse, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
References
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y., et al. jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
- Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. Calcium imaging analysis – How far have we come. F1000Research. 10, 258 (2021).
- Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).
- Stringer, C., Pachitariu, M. Computational processing of neural recordings from calcium imaging data. Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517 (2017).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. bioRxiv. , (2021).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Scientific Reports. 10, 7153 (2020).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Eglen, S. J., et al. Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience. Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).
- Pachitariu, M., et al. Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , (2017).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432 (2021).
- Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data. Nature Communications. 12, 6569 (2021).
- Moein, M., et al. CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool. Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Neugornet, A., O’Donovan, B., Ortinski, P. I. Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data. Frontiers in Neuroscience. 15, 620869 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Fazeli, E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Research. 9, 1279 (2020).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ni, L., et al. The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Omelchenko, A. A., et al. Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae. Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nature Communications. 9 (1), 4252 (2018).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis. Science Advances. 7 (35), (2021).
- Klein, M., et al. Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).
