TACI: البرنامج المساعد ImageJ لتحليل تصوير الكالسيوم 3D
Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) هو مكون إضافي ImageJ مفتوح المصدر لتحليل تصوير الكالسيوم 3D الذي يفحص الحركة على المحور z ويحدد القيمة القصوى لكل مكدس z لتمثيل شدة الخلية في النقطة الزمنية المقابلة. يمكنه فصل الخلايا العصبية المتداخلة في الاتجاه الجانبي (x / y) ولكن على مستويات z مختلفة.
Abstract
تطورت الأبحاث في علم الأعصاب لاستخدام أدوات التصوير والحوسبة المعقدة لاستخراج معلومات شاملة من مجموعات البيانات. تصوير الكالسيوم هو تقنية مستخدمة على نطاق واسع تتطلب برامج متطورة للحصول على نتائج موثوقة ، لكن العديد من المختبرات تكافح لاعتماد طرق حسابية عند تحديث البروتوكولات لتلبية المعايير الحديثة. تنشأ صعوبات بسبب نقص المعرفة البرمجية وجدران الدفع للبرمجيات. بالإضافة إلى ذلك ، تعرض الخلايا ذات الأهمية حركات في جميع الاتجاهات أثناء تصوير الكالسيوم. تم تطوير العديد من الأساليب لتصحيح الحركة في الاتجاه الجانبي (x / y).
تصف هذه الورقة سير عمل باستخدام مكون إضافي جديد ل ImageJ ، تحليل TrackMate لتصوير الكالسيوم (TACI) ، لفحص الحركة على المحور z في تصوير الكالسيوم 3D. يحدد هذا البرنامج الحد الأقصى لقيمة التألق من جميع المواضع z التي تظهر فيها الخلايا العصبية ويستخدمها لتمثيل شدة الخلايا العصبية في موضع t المقابل. لذلك ، يمكن لهذه الأداة فصل الخلايا العصبية المتداخلة في الاتجاه الجانبي (x / y) ولكنها تظهر على مستويات z متميزة. كمكون إضافي ل ImageJ ، يعد TACI أداة حسابية سهلة الاستخدام ومفتوحة المصدر لتحليل تصوير الكالسيوم 3D. لقد تحققنا من صحة سير العمل هذا باستخدام الخلايا العصبية الحساسة للحرارة ليرقات الذبابة التي عرضت الحركات في جميع الاتجاهات أثناء تقلب درجة الحرارة ومجموعة بيانات تصوير الكالسيوم 3D التي تم الحصول عليها من دماغ الذبابة.
Introduction
مستوى الكالسيوم داخل الخلايا هو علامة دقيقة على استثارة الخلايا العصبية. يقيس تصوير الكالسيوم التغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا لفهم النشاط العصبي1. استخدمت الدراسات في علم الأعصاب هذه الطريقة بشكل متزايد بسبب تطوير تقنيات لقياس تركيز الكالسيوم داخل الخلايا ، بما في ذلك مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) ، مثل GCaMP 2,3 ، والتي يمكن التعبير عنها بشكل غير جراحي في مجموعات محددة من الخلايا العصبية من خلال الأساليب الجينية. كما أدى انخفاض تكاليف الليزر ومكونات المجهر إلى زيادة استخدام تصوير الكالسيوم4. الأهم من ذلك ، يسمح تصوير الكالسيوم بتسجيل ودراسة الخلايا العصبية المفردة وكذلك مجموعات الخلايا العصبية الكبيرة في وقت واحد في الحيوانات التي تتحرك بحرية5.
ومع ذلك ، فإن تحليل بيانات تصوير الكالسيوم يمثل تحديا لأنه (1) يتضمن تتبع التغيرات في مضان الخلايا الفردية بمرور الوقت ، (2) تختفي إشارة التألق بشكل متقطع أو تظهر مرة أخرى مع الاستجابات العصبية ، و (3) قد تتحرك الخلايا العصبية في جميع الاتجاهات ، وتحديدا داخل وخارج المستوى البؤري أو تظهر على مستويات متعددة4 ، 6. يستغرق التحليل اليدوي وقتا طويلا ويصبح غير عملي مع زيادة طول التسجيلات وعدد الخلايا العصبية. تم تطوير برامج مختلفة لتسريع عملية تحليل تصوير الكالسيوم. في السابق ، تم تصميم البرامج في سياق تجريبي محدود ، مما يجعل من الصعب على المختبرات الأخرى اعتمادها. أدت الجهود الأخيرة لتلبية المعايير الحديثة لمشاركة البرامج إلى تطوير العديد من الأدوات التي يمكنها تحليل بيانات تصوير الكالسيوم باستمرار عبر مجموعات مختلفة7،8،9،10،11،12،13،14،15،16،17،18،19 . ومع ذلك ، تتطلب معظم هذه الأدوات معرفة برمجية و / أو تعتمد على برامج تجارية. إن الافتقار إلى المعرفة البرمجية وجدران الدفع البرمجية يمنع الباحثين من تبني هذه الأساليب. علاوة على ذلك ، تركز العديد من هذه الأدوات على تصحيح حركة x / y ، على الرغم من أن الحركة على المحور z تحتاج أيضا إلى تشخيص وتصحيح صريح6. هناك حاجة لأداة حسابية لتحليل تصوير الكالسيوم 3D الذي يركز على الخلايا العصبية التي تظهر z-drift وتظهر على طائرات z متعددة. من الناحية المثالية ، يجب أن تستخدم هذه الأداة برامج مفتوحة المصدر ولا تتطلب معرفة برمجية للسماح للمختبرات الأخرى باعتمادها بسهولة.
هنا ، قمنا بتطوير مكون إضافي جديد ل ImageJ ، TACI ، لتحليل بيانات تصوير الكالسيوم 3D. أولا ، يقوم البرنامج بإعادة تسمية ، إذا لزم الأمر ، وينظم بيانات تصوير الكالسيوم 3D حسب مواضع z. يتم تتبع الخلايا ذات الاهتمام في كل موضع z ، ويتم استخراج شدة مضانها بواسطة TrackMate أو أدوات حسابية أخرى. ثم يتم تطبيق TACI لفحص الحركة على المحور z. يحدد القيمة القصوى لمكدس z ويستخدمه لتمثيل كثافة الخلية في النقطة الزمنية المقابلة. يناسب سير العمل هذا تحليل تصوير الكالسيوم 3D مع الحركة في جميع الاتجاهات و / أو مع الخلايا العصبية المتداخلة في الاتجاه الجانبي (x / y) ولكنها تظهر في مواقع z مختلفة. للتحقق من صحة سير العمل هذا ، تم استخدام مجموعات بيانات تصوير الكالسيوم 3D من الخلايا العصبية الحساسة للحرارة ليرقات الذباب والخلايا العصبية للفطر في الدماغ. تجدر الإشارة إلى أن TACI هو مكون إضافي ImageJ مفتوح المصدر ولا يتطلب أي معرفة برمجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
طورت هذه الدراسة مكونا إضافيا جديدا ل ImageJ ، TACI ، ووصفت سير عمل لتحليل تصوير الكالسيوم 3D. تركز العديد من الأدوات المتاحة حاليا على تصحيح حركة x / y ، على الرغم من أن الحركة على المحور z تحتاج أيضا إلى تشخيص أو تصحيح صريح6. أثناء الحصول على الصورة في كائن حي ، لا يمكن تجنب الحركة على ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم استخدام Zeiss LSM 880 في مركز التصوير Fralin لجمع بيانات تصوير الكالسيوم. نحن نقدر الدكتورة ميشيل إل أولسن ويوهانغ بان لمساعدتهما في برنامج IMARIS. نعترف بالدكتور لينوود س. هيث لتعليقاته البناءة على المخطوطة وستيفن جيافاسيس لتعليقاته على ملف GitHub README. تم دعم هذا العمل من قبل NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) و NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) إلى L.N. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
References
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y., et al. jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
- Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. Calcium imaging analysis – How far have we come. F1000Research. 10, 258 (2021).
- Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).
- Stringer, C., Pachitariu, M. Computational processing of neural recordings from calcium imaging data. Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517 (2017).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. bioRxiv. , (2021).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Scientific Reports. 10, 7153 (2020).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Eglen, S. J., et al. Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience. Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).
- Pachitariu, M., et al. Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , (2017).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432 (2021).
- Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data. Nature Communications. 12, 6569 (2021).
- Moein, M., et al. CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool. Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Neugornet, A., O’Donovan, B., Ortinski, P. I. Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data. Frontiers in Neuroscience. 15, 620869 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Fazeli, E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Research. 9, 1279 (2020).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ni, L., et al. The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Omelchenko, A. A., et al. Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae. Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nature Communications. 9 (1), 4252 (2018).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis. Science Advances. 7 (35), (2021).
- Klein, M., et al. Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).
