Sviluppo di ceppi di specie di Leishmania con espressione costitutiva di eGFP

I parassiti protozoari del genere Leishmania causano la leishmaniosi, una malattia con una vasta gamma di manifestazioni cliniche. Questa malattia è prevalente in 98 paesi e la sua incidenza annuale è stimata tra 0,9 e 1,6 milioni di casi¹. Le specie di Leishmania che sono patogene per l’uomo sono divise in due sottogeneri, vale a dire L. (Leishmania) e L. (Viannia). Infezione con alcune specie appartenenti alla L. (Leishmania) sottogenere, come L. donovani e L. infantum, può provocare leishmaniosi viscerale (VL), che è fatale se non trattata². Specie appartenenti alla L. (Viannia) sono associati alla maggior parte dei casi di leishmaniosi cutanea (CL) e leishmaniosi mucocutanea (MCL) in America centrale e meridionale, in particolare a Panama, Colombia e Costa Rica, con L. panamensis che è il principale agente eziologico di queste presentazioni cliniche ^3,4.

La chemioterapia anti-leishmania esistente che include farmaci come antimoniali pentavalenti, miltefosina e amfotericina B è altamente tossica e costosa. Inoltre, l’aumento della resistenza ai farmaci negli ultimi decenni è stato aggiunto ai fattori che interferiscono con il trattamento efficace dei pazienti in tutto il mondo⁵. Differenze sostanziali sono state dimostrate tra le specie del genere Leishmania in relazione alla suscettibilità ai farmaci, in particolare tra le specie del Nuovo e del Vecchio Mondo ^6,7. Per questi motivi, è necessario indirizzare gli sforzi verso l’identificazione e lo sviluppo di nuovi farmaci anti-leishmania, prestando particolare attenzione agli approcci specie-specifici. Studiare grandi librerie di farmaci candidati con metodologie tradizionali è abbastanza difficile, dato che queste metodologie sono molto laboriose per valutare l’attività di composti contro amastigoti intracellulari o per eseguire esperimenti in vivo ⁸; Pertanto, è stato necessario sviluppare nuove tecniche che riducano questi svantaggi, compresa l’implementazione di geni reporter e lo sviluppo di saggi di screening fenotipico ad alto contenuto⁹.

L’uso di geni reporter ha dimostrato il potenziale per aumentare l’efficienza del processo di screening dei farmaci in quanto facilita lo sviluppo di saggi ad alto rendimento e in vivo. I parassiti ricombinanti della Leishmania che esprimono diversi geni reporter sono stati generati da vari gruppi di ricerca. I geni reporter, come la β-galattosidasi, la β-lattamasi e la luciferasi, sono stati introdotti in diverse specie di Leishmania utilizzando vettori episomiali, mostrando un’utilità limitata per lo screening dei farmaci nelle forme extra- e intracellulari del parassita 10,11,12,13,14,15. Questi approcci hanno il limite di richiedere una forte pressione selettiva in coltura per evitare l’eliminazione del costrutto episomiale, nonché l’uso di reagenti aggiuntivi per rivelare l’attività del gene reporter. Al contrario, la proteina fluorescente verde (GFP) e la sua variante, la proteina fluorescente verde potenziata (eGFP), sono state utilizzate nella generazione di un gran numero di ceppi transgenici di Leishmania per saggi di screening farmacologico in vitro grazie alla loro flessibilità e sensibilità, nonché alla possibilità di automatizzare il processo di screening utilizzando citometria a flusso o fluorometria^{15, 16,17,18,19}. Nonostante i risultati promettenti, le colture di questi ceppi transgenici erano altamente eterogenee nei loro livelli di fluorescenza, poiché il numero di copie del gene GFP non era lo stesso in tutti i parassiti. Inoltre, il mantenimento della fluorescenza richiedeva una pressione selettiva costante sui parassiti in coltura, poiché il gene GFP è stato introdotto in un costrutto episomiale.

Per le ragioni esposte in precedenza, molti sforzi si sono concentrati sullo sviluppo di nuove metodologie per la produzione di ceppi ricombinanti stabili. Questi sforzi si sono basati principalmente sull’integrazione dei geni reporter nei loci ribosomiali, sfruttando i più alti tassi di trascrizione dei geni ribosomiali²⁰. I ceppi di L. infantum e L. amazonensis sono stati generati dopo aver integrato i geni che codificano per β-galattocidasi 21, IFP 1.4, iRFP 22 e tdTomato²³, e sono stati valutati per la loro utilità nei saggi di screening dei farmaci. Vari gruppi hanno sviluppato ceppi di L. donovani che esprimono la GFP costitutivamente integrando il suo gene codificante nel locus dell’RNA ribosomiale 18S (locus ssu) attraverso la ricombinazione omologa^24,25; hanno mostrato un’espressione stabile e omogenea di GFP nella popolazione trasfettata, inclusi amastigoti intracellulari 24,25, e sono stati implementati con successo nei saggi di screening dei farmaci^24,25,26. Bolhassani et ^al.27 hanno sviluppato ceppi di L. major e L. infantum che esprimono GFP come transgene integrato. Hanno usato il vettore di integrazione pLEXSY, originariamente progettato per l’espressione transgenica di proteine in un sistema che utilizza L. tarentolae come ospite²⁸. Il vettore pLEXSY-GFP ha dimostrato di essere molto efficiente per la generazione di diversi ceppi di Leishmania che esprimono costitutivamente GFP 24,25,27,29,30. In questi parassiti, la fluorescenza è omogenea e mantenuta nelle forme intracellulari, potendo essere rilevata nelle lesioni del cuscinetto dei topi infetti²⁷.

In questo lavoro, descriviamo la metodologia utilizzata per generare ceppi di L. panamensis e L . donovani che esprimono il gene che codifica per eGFP come transgene integrato utilizzando il sistema pLEXSY. I ceppi generati attraverso questo processo sono utilizzati nel nostro laboratorio per eseguire saggi di screening farmacologico che valutano la potenziale attività anti-leishmania di molecole di origine naturale e sintetica.