eGFPの構成的発現を有する リーシュマニア 種株の開発

リーシュマニア属の原虫寄生虫は、広範囲の臨床症状を伴う疾患であるリーシュマニア症を引き起こす。この病気は98カ国で流行しており、年間発生率は0.9〜160万例と推定されています¹。人間に病原性のあるリーシュマニア種は、2つの亜属、すなわちLに分けられます。(リーシュマニア)とL。(ヴィアンニア)。Lに属するいくつかの種による感染。L. donovaniやL. ininftumなどの(リーシュマニア)亜属は、内臓リーシュマニア症(VL)を引き起こす可能性があり、治療せずに放置すると致命的です²。Lに属する種。(Viannia)亜属は、中南米、特にパナマ、コロンビア、コスタリカの皮膚リーシュマニア症(CL)および粘膜皮膚リーシュマニア症(MCL)のほとんどの症例に関連しており、L.パナメンシスがこれらの臨床症状の主な病因物質です^3,4。

五価アンチモン、ミルテフォシン、アムホテリシンBなどの薬剤を含む既存の抗リーシュマニア化学療法は、毒性が高く、高価です。さらに、ここ数十年間の薬剤耐性の増加は、世界中の患者の効果的な治療を妨げる要因に追加されています⁵。リーシュマニア属の種間、特に新世界と旧世界の種の間で、薬物感受性に関して実質的な違いが示されています^6,7。これらの理由から、種固有のアプローチに特に注意を払いながら、新しい抗リーシュマニア薬の同定と開発に努力する必要があります。従来の方法論で医薬品候補の大規模なライブラリを研究することは、これらの方法論が細胞内アマスティゴテスに対する化合物の活性を評価するため、またはin vivo^{実験を実行する}ために非常に面倒であることを考えると、非常に困難です8。したがって、レポーター遺伝子の実装やハイコンテント表現型スクリーニングアッセイの開発など、これらの欠点を軽減する新しい技術を開発する^{必要がありました9。}

レポーター遺伝子の使用は、ハイスループットおよびin vivoアッセイの開発を容易にするため、薬物スクリーニングプロセスの効率を高める可能性を示しています。いくつかのレポーター遺伝子を発現する組換えリーシュマニア寄生虫は、さまざまな研究グループによって生成されています。β-ガラクトシダーゼ、β-ラクタマーゼ、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子は、エピソーマルベクターを用いていくつかのリーシュマニア種に導入されており、寄生虫の細胞外および細胞内形態での薬物スクリーニングには限られた有用性が示されています10,11,12,13,14,15.これらのアプローチには、エピソーム構築物の排除を避けるために培養中に強い選択圧が必要であること、およびレポーター遺伝子の活性を明らかにするための追加の試薬の使用が必要であるという制限があります。逆に、緑色蛍光タンパク質(GFP)およびその変異体である増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)は、その柔軟性および感度、ならびにフローサイトメトリーまたは蛍光測定を用いたスクリーニングプロセスを自動化する可能性のために、in vitro薬物スクリーニングアッセイのための多数のトランスジェニックリーシュマニア株の生成に使用されてきた^15、 16、¹⁷、^18、19。有望な結果にもかかわらず、これらのトランスジェニック株の培養物は、GFP遺伝子のコピー数がすべての寄生虫で同じではなかったため、蛍光レベルが非常に不均一でした。さらに、蛍光を維持するには、GFP遺伝子がエピソーム構築物に導入されたため、培養中の寄生虫に対して一定の選択圧が必要でした。

前述の理由から、多くの努力が安定した組換え株を生産するための新しい方法論の開発に焦点を合わせてきました。これらの努力は、リボソーム遺伝子のより高い転写率を利用して、リボソーム遺伝子座へのレポーター遺伝子の統合に大きく依存してきました²⁰。β-ガラクトシダーゼ21、IFP 1.4、iRFP²²、tdTomato²³をコードする遺伝子を組み込んだL. infantumおよびL. amazonensis株を作製し、薬物スクリーニングアッセイにおける有用性を評価しています。さまざまなグループが、相同組換えを介してそのコード遺伝子を18SリボソームRNA遺伝子座(ssu遺伝子座)に組み込むことにより、GFPを構成的に発現するL.ドノバニ株を開発しました^24,25;それらは、細胞内アマスティゴテスを含むトランスフェクトされた集団において安定した均一なGFP発現を示し24,25、そしてそれらは薬物スクリーニングアッセイ^24,25,26において首尾よく実施された。Bolhassaniら²⁷は、組み込み導入遺伝子としてGFPを発現するL.メジャーおよびL.インファンタムの株を開発しました。彼らは、もともとL.タレントラエを宿主として使用するシステムにおけるタンパク質のトランスジェニック発現のために設計された組み込みベクターpLEXSYを使用しました²⁸。pLEXSY-GFPベクターは、GFP²⁴、²⁵、^27、29、30を構成的に発現する異なるリーシュマニア株の生成に非常に効率的であることが示されています。これらの寄生生物において、蛍光は均質であり、細胞内形態で維持され、感染したマウスの足蹠病変において検出することができる²⁷。

本研究では、pLEXSYシステムを用いて、eGFPをコードする遺伝子を統合導入遺伝子として発現するL. パナメンシス 株および L.ドノバニ 株を作製するために使用される方法論について説明します。このプロセスで生成された菌株は、天然および合成起源の分子の潜在的な抗リーシュマニア活性を評価する薬物スクリーニングアッセイを実行するために私たちの研究室で使用されます。