JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

تطوير سلالات أنواع الليشمانيا مع التعبير التأسيسي ل eGFP

Published: April 21, 2023
doi:
10.3791/64939
, , , , , , ,
1Centro de Biología Celular y Molecular de Enfermedades,Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT-AIP), 2Departamento de Medios y Creativo,Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT-AIP), 3Sistema Nacional de Investigación-Secretaría Nacional de Ciencia,Tecnología e Innovación (SNI-SENACYT)

Summary

هنا ، نصف المنهجية المستخدمة لتوليد سلالات L. panamensis و L . donovani التي تعبر عن جين eGFP كجين تحوير متكامل مستقر باستخدام نظام pLEXSY. تم استنساخ الطفيليات المنقولة عن طريق الحد من التخفيف ، وتم اختيار الحيوانات المستنسخة ذات أعلى كثافة مضان في كلا النوعين لاستخدامها مرة أخرى في فحوصات فحص الأدوية.

Abstract

تسبب الطفيليات الأولية من جنس الليشمانيا داء الليشمانيات ، وهو مرض له مظاهر سريرية متغيرة يصيب ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم. يمكن أن تؤدي العدوى ب L. donovani إلى مرض حشوي مميت. في بنما وكولومبيا وكوستاريكا ، L. panamensis هو المسؤول عن معظم الحالات المبلغ عنها من داء الليشمانيات الجلدي والمخاطي. إن دراسة عدد كبير من الأدوية المرشحة بالمنهجيات المتاحة حتى الآن أمر صعب للغاية ، نظرا لأنها شاقة للغاية لتقييم نشاط المركبات ضد الأشكال داخل الخلايا للطفيلي أو لأداء المقايسات في الجسم الحي . في هذا العمل ، نصف جيل سلالات L. panamensis و L. donovani مع التعبير التأسيسي للجين الذي يشفر لبروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (eGFP) المدمج في الموضع الذي يشفر ل 18S rRNA (ssu). تم الحصول على eGFP المشفر الجيني من ناقل تجاري وتم تضخيمه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لإثرائه وإضافة مواقع تقييد لإنزيمات BglII و KpnI. تم عزل أمبليكون eGFP عن طريق تنقية هلام الأغاروز ، وهضمه مع الإنزيمات BglII و KpnI ، وربطه في ناقل تعبير الليشمانيا pLEXSY-sat2.1 الذي تم هضمه مسبقا بنفس مجموعة الإنزيمات. تم نشر ناقل التعبير مع الجين المستنسخ في الإشريكية القولونية ، وتنقيته ، وتم التحقق من وجود الإدراج بواسطة مستعمرة PCR. تم تحويل البلازميد المنقى خطيا واستخدامه لنقل طفيليات L. donovani و L . panamensis. تم التحقق من تكامل الجين بواسطة PCR. تم تقييم التعبير عن جين eGFP عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم استنساخ الطفيليات الفلورية عن طريق الحد من التخفيف ، وتم اختيار الحيوانات المستنسخة ذات أعلى كثافة مضان باستخدام قياس التدفق الخلوي.

Introduction

الطفيليات الأولية من جنس الليشمانيا تسبب داء الليشمانيات ، وهو مرض له مجموعة واسعة من المظاهر السريرية. ينتشر هذا المرض في 98 دولة ، ويقدر معدل حدوثه السنوي ب 0.9 إلى 1.6 مليون حالة1. تنقسم أنواع الليشمانيا المسببة للأمراض للإنسان إلى جنسين فرعيين ، وهما L. (الليشمانيا) ول. (فيانيا). العدوى مع بعض الأنواع التي تنتمي إلى L. (الليشمانيا) قد يؤدي الجنس الفرعي ، مثل L. donovani و L. infantum ، إلى داء الليشمانيات الحشوي (VL) ، وهو قاتل إذا ترك دون علاج2. الأنواع التي تنتمي إلى L. يرتبط الجنس الفرعي (Viannia) بمعظم حالات داء الليشمانيات الجلدي (CL) وداء الليشمانيات المخاطي الجلدي (MCL) في أمريكا الوسطى والجنوبية ، وخاصة في بنما وكولومبيا وكوستاريكا ، مع كون L. panamensis العامل المسبب الرئيسي لهذه العروض السريرية 3,4.

العلاج الكيميائي الحالي المضاد لليشمانيا الذي يتضمن أدوية مثل الأنتيمون خماسي التكافؤ وميلتيفوسين والأمفوتريسين ب شديد السمية ومكلف. وعلاوة على ذلك، أضيفت زيادة مقاومة الأدوية خلال العقود الأخيرة إلى العوامل التي تتداخل مع العلاج الفعال للمرضى في جميع أنحاء العالم5. تم إثبات اختلافات جوهرية عبر أنواع جنس الليشمانيا فيما يتعلق بالحساسية للأدوية ، خاصة بين أنواع العالم الجديدوالقديم 6,7. لهذه الأسباب ، من الضروري توجيه الجهود لتحديد وتطوير عقاقير جديدة لمكافحة الليشمانيا ، مع إيلاء اهتمام خاص للنهج الخاصة بالأنواع. من الصعب للغاية دراسة المكتبات الكبيرة للأدوية المرشحة ذات المنهجيات التقليدية ، نظرا لأن هذه المنهجيات شاقة للغاية لتقييم نشاط المركبات ضد الأماستيجوتات داخل الخلايا أو لإجراء تجارب في الجسم الحي 8 ؛ لذلك ، كان من الضروري تطوير تقنيات جديدة تقلل من هذه العيوب ، بما في ذلك تنفيذ جينات المراسل وتطوير فحوصات فحص النمط الظاهري عالية المحتوى9.

أظهر استخدام جينات المراسل إمكانية زيادة كفاءة عملية فحص الأدوية لأنها تسهل تطوير فحوصات عالية الإنتاجية وفي الجسم الحي. تم إنشاء طفيليات الليشمانيا المؤتلفة التي تعبر عن العديد من جينات المراسل من قبل مجموعات بحثية مختلفة. تم إدخال جينات المراسل ، مثل β-galactosidase و β-lactamase و luciferase ، في العديد من أنواع الليشمانيا باستخدام النواقل العرضية ، مما يدل على فائدة محدودة لفحص الأدوية في أشكال خارج الخلايا وداخلها من الطفيلي 10،11،12،13،14،15. هذه الأساليب لها حدود تتطلب ضغطا انتقائيا قويا في الثقافة لتجنب القضاء على البنية العرضية ، وكذلك استخدام كواشف إضافية للكشف عن نشاط جين المراسل. على العكس من ذلك ، تم استخدام بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ومتغيره ، بروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (eGFP) ، في توليد عدد كبير من سلالات الليشمانيا المعدلة وراثيا لفحوصات فحص الأدوية في المختبر بسبب مرونتها وحساسيتها ، وكذلك إمكانية أتمتة عملية الفحص باستخدام قياس التدفق الخلوي أو القياس الفلوري15 ، 16,17,18,19. على الرغم من النتائج الواعدة ، كانت مزارع هذه السلالات المعدلة وراثيا غير متجانسة للغاية في مستويات مضانها ، لأن عدد نسخ جين GFP لم يكن هو نفسه في جميع الطفيليات. علاوة على ذلك ، يتطلب الحفاظ على التألق ضغطا انتقائيا ثابتا على الطفيليات في الثقافة ، حيث تم إدخال جين GFP في بنية عرضية.

للأسباب المذكورة من قبل ، ركزت العديد من الجهود على تطوير منهجيات جديدة لإنتاج سلالات مستقرة مؤتلفة. اعتمدت هذه الجهود في الغالب على دمج جينات المراسل في المواقع الريبوسومية ، مستفيدة من معدلات النسخ الأعلى للجينات الريبوسومية20. تم إنشاء سلالات من L. infantum و L. amazonensis بعد دمج الجينات المشفرة ل β-galactocidase 21 و IFP 1.4 و iRFP22 و tdTomato23 ، وتم تقييمها لفائدتها في فحوصات فحص الأدوية. طورت مجموعات مختلفة سلالات L. donovani التي تعبر عن GFP بشكل أساسي من خلال دمج جينها المشفر في موضع الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي 18S (ssu locus) من خلال إعادة التركيب المتماثل24,25 ؛ أظهروا تعبيرا مستقرا ومتجانسا عن GFP في السكان المنقولين ، بما في ذلك amastigotes داخل الخلايا 24,25 ، وتم تنفيذها بنجاح في فحوصات فحص المخدرات24,25,26. طور Bolhassani et al.27 سلالات من L. major و L. infantum تعبر عن GFP كجين تحوير متكامل. استخدموا ناقل التكامل pLEXSY ، المصمم أصلا للتعبير الوراثي للبروتينات في نظام يستخدم L. tarentolae كمضيف28. أظهر ناقل pLEXSY-GFP أنه فعال للغاية لتوليد سلالات مختلفة من الليشمانيا تعبر بشكل أساسي عن GFP24،25،27،29،30. في هذه الطفيليات ، يكون التألق متجانسا ويتم الحفاظ عليه في الأشكال داخل الخلايا ، حيث يمكن اكتشافه في آفات وسادة القدم للفئران المصابة27.

في هذا العمل ، نصف المنهجية المستخدمة لتوليد سلالات L. panamensis و L . donovani التي تعبر عن تشفير الجينات ل eGFP كجين تحوير متكامل باستخدام نظام pLEXSY. تستخدم السلالات الناتجة عن هذه العملية في مختبرنا لإجراء فحوصات فحص الأدوية التي تقيم النشاط المحتمل لمكافحة الليشمانيا للجزيئات ذات الأصل الطبيعي والاصطناعي.

Protocol

للحفاظ على العينات معقمة ، يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على زراعة الطفيليات داخل غطاء مستوى السلامة البيولوجية 2 (BSL-2) أو وفقا للوائح الصحة والسلامة المحلية. يمكن العثور على ملخص بياني لهذا البروتوكول في الشكل 1. <img alt="Figure 1" class="xfigim…

Representative Results

بعد بناء بنية pLEXSY-eGFP وتحويل خلايا الإشريكية القولونية المختصة ، ستولد المستعمرات التي تحتوي على البنية مع إدراج eGFP منتجا يبلغ 859 نقطة أساس تقريبا بعد تشغيل مستعمرة PCR الموصوفة في القسم 1.2 (الشكل 3 أ). يجب أن يعطي الهضم الكلي للبلازميد المنقى من المستعمرات الإيجابية باست?…

Discussion

تمت دراسة مزايا وعيوب جينات المراسل المختلفة في العديد من الطفيليات الأولية. من بينها ، GFP و eGFP هي في جوهرها الفلورسنت وتسمح بسهولة القياس الكمي والتصوير. يمكن الكشف عن النشاط الفلوري لهذه البروتينات بأقل قدر من التلاعب باستخدام الفحص المجهري الفلوري أو القياس الفلوري أو قياس التدفق الخل?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل الأمانة الوطنية للعلوم والتكنولوجيا والابتكار (SENACYT) ، بنما ، رقم المنحة NI-177-2016 ، والنظام الوطني للبحوث (SNI) ، بنما ، أرقام المنح SNI-169-2018 و SNI-008-2022 و SNI-060-2022.

Materials

96 Well Microplates Corning CLS3340 Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid
Agarose Sigma-Aldrich A4718
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A8351 BioXtra, suitable for cell culture
BglII restriction enzyme New England BioLabs R0144S 2,000 units. 10,000 units/mL
Cell Culture Flasks Corning CLS430168 Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal)
ChemiDoc Imaging System Bio-Rad 17001401
CyFlow Space Sysmex Not available
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021 powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F7524
Gel Loading Buffer Sigma-Aldrich G2526  The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading.
Gene Pulser Xcell Electroporation System Bio-Rad 1652660 The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber.
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes Bio-Rad 1652086 Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells
Gentamicin solution Sigma-Aldrich G1397 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
GoTaq Long PCR Master Mix Promega M4021
HEPES solution Sigma-Aldrich H0887 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Inverted microscope Olympus IXplore Standard
KpnI-HF restriction enzyme New England BioLabs R3142S 4,000 units. 20,000 units/mL
LB Broth with agar Sigma-Aldrich L3147 Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture.
LB Broth  Sigma-Aldrich L2542 Liquid microbial growth medium
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System Bio-Rad 1640300 Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray
pEGFP-N1-1x Addgene 172281 Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence
pLEXSYcon2.1 expression kit Jena Bioscience EGE-1310sat Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing.
Potassium Chloride Millipore 529552 Molecular Biology Grade – CAS 7447-40-7 – Calbiochem
PureYield Plasmid Miniprep System Promega A1222 Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures.
Schneider′s Insect Medium Sigma-Aldrich S0146 Medium used in our laboratory for culturing Leishmania.
SOC Medium Sigma-Aldrich S1797
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014 for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration)
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich RDD038 BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri
SwaI restriction enzyme New England BioLabs R0604S 2,000 units. 10,000 units/mL
Syringe filters Corning CLS431212 regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096 Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring
T4 DNA Ligase Promega M1801 Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich T4415 BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Promega A9285
XL10-Gold Ultracompetent Cells Agilent 200317 XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 7 (5), e35671 (2012).
  2. Franssen, S. U., et al. Global genome diversity of the Leishmania donovani complex. eLife. 9, e51243 (2020).
  3. Saldaña, A., et al. Clinical cutaneous leishmaniasis rates are associated with household Lutzomyia gomezi, Lu. Panamensis, and Lu. trapidoi abundance in Trinidad de Las Minas, western Panama. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 88 (3), 572-574 (2013).
  4. Ramírez, J. D., et al. Taxonomy, diversity, temporal and geographical distribution of Cutaneous Leishmaniasis in Colombia: A retrospective study. Scientific Reports. 6, 28266 (2016).
  5. Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
  6. Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 399-410 (2006).
  7. Croft, S. L., Yardley, V., Kendrick, H. Drug sensitivity of Leishmania species: some unresolved problems. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 96, S127-S129 (2002).
  8. Sereno, D., Cordeiro da Silva, A., Mathieu-Daude, F., Ouaissi, A. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitology International. 56 (1), 3-7 (2007).
  9. Don, R., Ioset, J. R. Screening strategies to identify new chemical diversity for drug development to treat kinetoplastid infections. Parasitology. 141 (1), 140-146 (2014).
  10. Sereno, D., Roy, G., Lemesre, J. L., Papadopoulou, B., Ouellette, M. DNA transformation of Leishmania infantum axenic amastigotes and their use in drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1168-1173 (2001).
  11. Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Molecular and Biochemical Parasitology. 110 (2), 195-206 (2000).
  12. Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cellular Microbiology. 7 (3), 383-392 (2005).
  13. Ashutosh, G. S., Ramesh, S. S., Goyal, N. Use of Leishmania donovani field isolates expressing the luciferase reporter gene in in vitro drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (9), 3776-3783 (2005).
  14. Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania amastigotes grown in macrophages. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 72 (5), 600-605 (2005).
  15. Okuno, T., Goto, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H., Matsumoto, Y. Applications of recombinant Leishmania amazonensis expressing egfp or the beta-galactosidase gene for drug screening and histopathological analysis. Experimental Animals. 52 (2), 109-118 (2003).
  16. Kamau, S. W., Grimm, F., Hehl, A. B. Expression of green fluorescent protein as a marker for effects of antileishmanial compounds in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3654-3656 (2001).
  17. Singh, N., Dube, A. Short report: fluorescent Leishmania: application to anti-leishmanial drug testing. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 71 (4), 400-402 (2004).
  18. Dube, A., Singh, N., Sundar, S., Singh, N. Refractoriness to the treatment of sodium stibogluconate in Indian kala-azar field isolates persist in in vitro and in vivo experimental models. Parasitology Research. 96 (4), 216-223 (2005).
  19. Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitology Research. 89 (4), 266-271 (2003).
  20. Boucher, N., McNicoll, F., Dumas, C., Papadopoulou, B. RNA polymerase I-mediated transcription of a reporter gene integrated into different loci of Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 119 (1), 153-158 (2002).
  21. da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
  22. Calvo-Álvarez, E., et al. Infrared fluorescent imaging as a potent tool for in vitro, ex vivo and in vivo models of visceral leishmaniasis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003666 (2015).
  23. García-Bustos, M. F., et al. Development of a fluorescent assay to search new drugs using stable tdtomato-leishmania, and the selection of galangin as a candidate with anti-leishmanial activity. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 666746 (2021).
  24. Singh, N., Gupta, R., Jaiswal, A. K., Sundar, S., Dube, A. Transgenic Leishmania donovani clinical isolates expressing green fluorescent protein constitutively for rapid and reliable ex vivo drug screening. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (2), 370-374 (2009).
  25. De Rycker, M., et al. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
  26. Peña, I., et al. New compound sets identified from high throughput phenotypic screening against three kinetoplastid parasites: an open resource. Scientific Reports. 5, 8771 (2015).
  27. Bolhassani, A., et al. Fluorescent Leishmania species: development of stable GFP expression and its application for in vitro and in vivo studies. Experimental Parasitology. 127 (3), 637-645 (2011).
  28. Breitling, R., et al. Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for protein research and production. Protein Expression and Purification. 25 (2), 209-218 (2002).
  29. Pulido, S. A., et al. Improvement of the green fluorescent protein reporter system in Leishmania spp. for the in vitro and in vivo screening of antileishmanial drugs. Acta Tropica. 122 (1), 36-45 (2012).
  30. Bastos, M. S. E., et al. Achievement of constitutive fluorescent pLEXSY-egfp Leishmania braziliensis and its application as an alternative method for drug screening in vitro. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (2), 155-159 (2017).
  31. Vincze, T., Posfai, J., Roberts, R. J. NEBcutter: A program to cleave DNA with restriction enzymes. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3688-3691 (2003).
  32. Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
  33. Green, M., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth Edition. , (2012).
  34. Santarém, N., et al. The impact of distinct culture media in Leishmania infantum biology and infectivity. Parasitology. 141 (2), 192-205 (2014).
  35. Medina-Acosta, E., Cross, G. A. Rapid isolation of DNA from trypanosomatid protozoa using a simple "mini-prep" procedure. Molecular and Biochemical Parasitology. 59 (2), 327-329 (1993).
  36. Ye, M., Wilhelm, M., Gentschev, I., Szalay, A. A modified limiting dilution method for monoclonal stable cell line selection using a real-time fluorescence imaging system: a practical workflow and advanced applications. Methods and Protocols. 4 (1), 16 (2021).
  37. Varela, M. R. E., et al. Leishmania (Viannia) panamensis: an in vitro assay using the expression of GFP for screening of antileishmanial drug. Experimental Parasitology. 122 (2), 134-139 (2009).
  38. Komura, T., et al. ER stress induced impaired TLR signaling and macrophage differentiation of human monocytes. Cellular Immunology. 282 (1), 44-52 (2013).

Tags

LeishmaniaEGFPHigh-throughput ScreeningPCRCloningPlasmidTransfectionParasite Culture

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Carrasco, J., Chang, J. H., Pineda, L., Quintero, I., Giovani, R., Spadafora, C., Lleonart, R., Restrepo, C. M. Development of Leishmania Species Strains with Constitutive Expression of eGFP. J. Vis. Exp. (194), e64939, doi:10.3791/64939 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image