Развитие штаммов видов Leishmania с конститутивной экспрессией eGFP

Простейшие паразиты рода Leishmania вызывают лейшманиоз – заболевание с широким спектром клинических проявлений. Это заболевание распространено в 98 странах, а его ежегодная заболеваемость оценивается в 0,9–1,6 миллиона^{случаев1}. Виды Leishmania, патогенные для человека, подразделяются на два подрода, а именно L. (Leishmania) и L. (Вянния). Заражение некоторыми видами, относящимися к L. Подроды (Leishmania), такие как L. donovani и L. infantum, могут приводить к висцеральному лейшманиозу (ВЛ), который приводит к летальному исходу, если его не лечить². Виды, принадлежащие к семейству L. Подрод (Viannia) ассоциирован с большинством случаев кожного лейшманиоза (КЛ) и слизисто-кожного лейшманиоза (МКЛ) в Центральной и Южной Америке, особенно в Панаме, Колумбии и Коста-Рике, причем L. panamensis является основным этиологическим агентом этих клинических проявлений ^3,4.

Существующая химиотерапия против лейшмании, которая включает такие препараты, как пятивалентные сурьмяны, милтефосин и амфотерицин В, является высокотоксичной и дорогостоящей. Кроме того, к факторам, препятствующим эффективному лечению^{пациентов во всем} мире, добавилась возросшая в последние десятилетия лекарственная устойчивость 5. Существенные различия были продемонстрированы между видами рода Leishmania в отношении восприимчивости к лекарственным препаратам, особенно между видами Нового и Старого Света ^6,7. По этим причинам необходимо направлять усилия на выявление и разработку новых препаратов против лейшмании, уделяя особое внимание видоспецифичным подходам. Изучение больших библиотек лекарственных препаратов-кандидатов с помощью традиционных методологий является достаточно сложным, учитывая, что эти методики очень трудоемки для оценки активности соединений в отношении внутриклеточных амастигот или для проведения экспериментов in vivo ⁸; В связи с этим возникла необходимость в разработке новых методов, позволяющих уменьшить эти недостатки, включая внедрение репортерных генов и разработку высокосодержательных фенотипических скрининговых тестов⁹.

Использование репортерных генов показало потенциал для повышения эффективности процесса скрининга лекарственных средств, поскольку это облегчает разработку высокопроизводительных анализов и анализов in vivo. Рекомбинантные паразиты Leishmania, экспрессирующие несколько репортерных генов, были созданы различными исследовательскими группами. Репортерные гены, такие как β-галактозидаза, β-лактамаза и люцифераза, были введены у нескольких видов Leishmania с использованием эписомальных векторов, что показало ограниченную полезность для скрининга лекарств во вне- и внутриклеточных формах паразита 10,11,12,13,14,15. Эти подходы имеют ограничение, заключающееся в том, что они требуют сильного селективного давления в культуре, чтобы избежать элиминации эписомальной конструкции, а также использования дополнительных реагентов для выявления активности репортерного гена. И наоборот, зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его вариант, усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), были использованы при генерации большого количества трансгенных штаммов лейшмании для скрининговых анализов на лекарственные препараты in vitro благодаря их гибкости и чувствительности, а также возможности автоматизации процесса скрининга с помощью проточной цитометрии или флуорометрии^{15. 16,17,18,19}. Несмотря на многообещающие результаты, культуры этих трансгенных штаммов были крайне неоднородны по уровню флуоресценции, поскольку количество копий гена GFP не было одинаковым у всех паразитов. Кроме того, поддержание флуоресценции требовало постоянного селективного давления на паразитов в культуре, поскольку ген GFP был введен в эписомальную конструкцию.

По причинам, изложенным выше, многие усилия были сосредоточены на разработке новых методологий получения стабильных рекомбинантных штаммов. Эти усилия в основном основывались на интеграции репортерных генов в рибосомные локусы, используя преимущества более высокой скорости транскрипции рибосомных генов²⁰. Штаммы L. infantum и L. amazonensis были получены с интеграцией генов, кодирующих β-галактоцидазу 21, IFP 1.4, iRFP²² и tdTomato²³, и они были оценены на предмет их полезности в скрининговых тестах на наркотики. В различных группах были выведены штаммы L. donovani, которые конститутивно экспрессируют GFP путем интеграции его кодирующего гена в локус 18S рибосомной РНК (локус ssu) посредством гомологичной рекомбинации^24,25; они показали стабильную и гомогенную экспрессию GFP в трансфицированной популяции, включая внутриклеточные амастиготы 24,25, и были успешно реализованы в скрининговых анализах на лекарственные препараты^24,25,26. Bolhassani et ^al.27 разработали штаммы L. major и L. infantum, экспрессирующие GFP в виде интегрированного трансгена. Они использовали интеграционный вектор pLEXSY, первоначально разработанный для трансгенной экспрессии белков в системе, использующей L. tarentolae в качестве хозяина²⁸. Вектор pLEXSY-GFP показал себя очень эффективным для генерации различных штаммов Leishmania, конститутивно экспрессирующих GFP 24,25,27,29,30. У этих паразитов флуоресценция однородна и поддерживается во внутриклеточных формах, что может быть обнаружено в поражениях подушечек лап инфицированных мышей²⁷.

В данной работе описана методика получения штаммов L. panamensis и L . donovani , экспрессирующих ген, кодирующий eGFP, в виде интегрированного трансгена с использованием системы pLEXSY. Штаммы, полученные в результате этого процесса, используются в нашей лаборатории для проведения скрининговых анализов на наркотики, которые оценивают потенциальную антилейшманийную активность молекул природного и синтетического происхождения.