התפתחות זני לישמניה עם ביטוי מכונן של eGFP

טפילים פרוטוזואניים מהסוג לישמניה גורמים ללישמניאזיס, מחלה בעלת מגוון רחב של ביטויים קליניים. מחלה זו נפוצה ב-98 מדינות, ושכיחותה השנתית נאמדת ב-0.9 עד 1.6 מיליון מקרים¹. מיני לישמניה שהם פתוגניים לבני אדם מחולקים לשני תת-סוגים, כלומר L. (לישמניה) ול’. (ויאניה). זיהום עם כמה מינים השייכים L. תת-סוג (לישמניה), כגון L. donovani ו-L. infantum, עלול לגרום ללישמניאזיס ויסצרלי (VL), שהוא קטלני אם אינו מטופל². מינים השייכים ל– L. תת-סוג (Viannia) קשור לרוב המקרים של לישמניאזיס עורי (CL) ולישמניאזיס רירית (MCL) במרכז ודרום אמריקה, במיוחד בפנמה, קולומביה וקוסטה ריקה, כאשר L. panamensis הוא הסוכן האטיולוגי העיקרי של מצגות קליניות אלה ^3,4.

כימותרפיה קיימת נגד לישמניה הכוללת תרופות כגון אנטימוניאלים מחומשים, מילטפוסין ואמפוטריצין B היא רעילה מאוד ויקרה. יתר על כן, עמידות מוגברת לתרופות בעשורים האחרונים נוספה לגורמים המפריעים לטיפול יעיל בחולים ברחבי העולם⁵. הבדלים משמעותיים הודגמו בין מינים בסוג לישמניה ביחס לרגישות לתרופות, במיוחד בין מינים בעולם החדש והישן ^6,7. מסיבות אלה, יש צורך להפנות מאמצים לזיהוי ופיתוח של תרופות חדשות נגד לישמניה, תוך מתן תשומת לב מיוחדת לגישות ספציפיות למינים. לימוד ספריות גדולות של מועמדים לתרופות עם מתודולוגיות מסורתיות הוא די קשה, בהתחשב בכך מתודולוגיות אלה הם מאוד מייגע להערכת הפעילות של תרכובות נגד amastigotes תאית או לביצוע ניסויים in vivo ⁸; לכן, היה צורך לפתח טכניקות חדשות המפחיתות חסרונות אלה, כולל יישום גנים של כתב ופיתוח בדיקות סינון פנוטיפיות בעלות תוכן גבוה⁹.

השימוש בגנים של כתבים הראה את הפוטנציאל להגביר את היעילות של תהליך סינון התרופות מכיוון שהוא מאפשר פיתוח של מבחני תפוקה גבוהה ו– in vivo. טפילי לישמניה רקומביננטיים המבטאים מספר גנים של כתבים נוצרו על ידי קבוצות מחקר שונות. גנים עיתונאיים, כגון β-גלקטוזידאז, β-לקטמאז ולוציפראז, הוכנסו למספר מיני לישמניה באמצעות וקטורים אפיזומליים, והראו תועלת מוגבלת לבדיקת תרופות בצורות חוץ-תאיות ותוך-תאיות של הטפיל 10,11,12,13,14,15. גישות אלה יש את המגבלה של דרישת לחץ סלקטיבי חזק בתרבית כדי למנוע חיסול של המבנה האפיזומלי, כמו גם את השימוש בריאגנטים נוספים כדי לחשוף את הפעילות של הגן המדווח. לעומת זאת, החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) וגרסתו, החלבון הפלואורסצנטי הירוק המשופר (eGFP), שימשו ביצירת מספר רב של זני לישמניה טרנסגניים לבדיקות סקר תרופות חוץ גופיות בשל גמישותם ורגישותם, כמו גם האפשרות להפוך את תהליך הסינון לאוטומטי באמצעות ציטומטריית זרימה או פלואורומטריה^{15, 16,17,18,19}. למרות התוצאות המבטיחות, תרביות של זנים טרנסגניים אלה היו הטרוגניות מאוד ברמות הפלואורסצנטיות שלהם, שכן מספר העותקים של הגן GFP לא היה זהה בכל הטפילים. יתר על כן, שמירה על פלואורסצנטיות דרשה לחץ סלקטיבי מתמיד על הטפילים בתרבית, שכן הגן GFP הוכנס במבנה אפיזומלי.

מהסיבות שצוינו קודם לכן, מאמצים רבים התמקדו בפיתוח מתודולוגיות חדשות לייצור זנים רקומביננטיים יציבים. מאמצים אלה הסתמכו בעיקר על שילוב של גנים מדווחים לתוך loci ריבוזומלי, תוך ניצול שיעורי השעתוק הגבוהים יותר של גנים ריבוזומליים²⁰. זנים של L. infantum ו- L. amazonensis נוצרו לאחר ששילבו את הגנים המקודדים עבור β-galactocidase 21, IFP 1.4, iRFP²² ו- tdTomato²³, והם הוערכו על יעילותם בבדיקות סינון תרופות. קבוצות שונות פיתחו זני L. donovani המבטאים GFP באופן קונסטיטוטיבי על ידי שילוב גן הקידוד שלו בלוקוס RNA ריבוזומלי 18S (ssu locus) באמצעות רקומבינציה הומולוגית^24,25; הם הראו ביטוי GFP יציב והומוגני באוכלוסייה הנגועה, כולל אמסטיגוטים תוך-תאיים 24,25, והם יושמו בהצלחה בבדיקות סקר תרופות^24,25,26. Bolhassani et ^al.27 פיתחו זנים של L. major ו– L. infantum המבטאים GFP כטרנסגן משולב. הם השתמשו בווקטור האינטגרציה pLEXSY, שתוכנן במקור עבור ביטוי מהונדס של חלבונים במערכת באמצעות L. tarentolae כמארח²⁸. וקטור pLEXSY-GFP הוכח כיעיל מאוד ליצירת זני לישמניה שונים המבטאים באופן מכונן GFP 24,25,27,29,30. בטפילים אלה, פלואורסצנטיות היא הומוגנית ומתוחזקת בצורות תוך תאיות, להיות מסוגל להיות מזוהה נגעים כרית רגל של עכברים נגועים²⁷.

בעבודה זו, אנו מתארים את המתודולוגיה המשמשת ליצירת זנים L. panamensis ו- L. donovani המבטאים את הגן המקודד ל- eGFP כטרנסגן משולב באמצעות מערכת pLEXSY. הזנים הנוצרים בתהליך זה משמשים במעבדה שלנו לביצוע בדיקות סינון תרופות המעריכות את הפעילות האנטי-לישמניה הפוטנציאלית של מולקולות ממקור טבעי וסינתטי.