Entwicklung von Leishmania-Speziesstämmen mit konstitutiver Expression von eGFP

Protozoische Parasiten der Gattung Leishmania verursachen Leishmaniose, eine Krankheit mit einem breiten Spektrum klinischer Manifestationen. Diese Krankheit ist in 98 Ländern verbreitet und ihre jährliche Inzidenz wird auf 0,9 bis 1,6 Millionen Fälle geschätzt¹. Leishmania-Arten, die für den Menschen pathogen sind, werden in zwei Untergattungen unterteilt, nämlich L. (Leishmanien) und L. (Viannia). Infektion mit einigen Arten, die zur L. Untergattungen (Leishmania), wie L. donovani und L. infantum, können zu viszeraler Leishmaniose (VL) führen, die unbehandelt tödlich verläuft². Arten, die zur L. (Viannia) sind mit den meisten Fällen von kutaner Leishmaniose (CL) und mukokutaner Leishmaniose (MCL) in Mittel- und Südamerika, insbesondere in Panama, Kolumbien und Costa Rica, assoziiert, wobei L. panamensis der wichtigste ätiologische Erreger dieser klinischen Erscheinungsformen ist ^3,4.

Die bestehende Chemotherapie gegen Leishmanien, die Medikamente wie fünfwertige Antimonia, Miltefosin und Amphotericin B umfasst, ist hochgiftig und teuer. Darüber hinaus sind in den letzten Jahrzehnten erhöhte Arzneimittelresistenzen zu den Faktoren hinzugekommen, die die wirksame Behandlung von Patienten weltweit beeinträchtigen⁵. Zwischen den Arten der Gattung Leishmania wurden erhebliche Unterschiede in Bezug auf die Arzneimittelempfindlichkeit nachgewiesen, insbesondere zwischen Arten der Neuen und der Alten Welt ^6,7. Aus diesen Gründen ist es notwendig, die Anstrengungen auf die Identifizierung und Entwicklung neuer Medikamente gegen Leishmanien zu richten, wobei den speziesspezifischen Ansätzen besondere Aufmerksamkeit zu widmen ist. Die Untersuchung großer Bibliotheken von Wirkstoffkandidaten mit herkömmlichen Methoden ist recht schwierig, da diese Methoden sehr mühsam sind, um die Aktivität von Verbindungen gegen intrazelluläre Amastigoten zu bewerten oder In-vivo-Experimente durchzuführen⁸; Daher war es notwendig, neue Techniken zu entwickeln, die diese Nachteile verringern, einschließlich der Implementierung von Reportergenen und der Entwicklung von phänotypischen High-Content-Screening-Assays⁹.

Die Verwendung von Reportergenen hat gezeigt, dass sie das Potenzial haben, die Effizienz des Wirkstoff-Screening-Prozesses zu erhöhen, da sie die Entwicklung von Hochdurchsatz- und In-vivo-Assays erleichtert. Rekombinante Leishmania-Parasiten, die mehrere Reportergene exprimieren, wurden von verschiedenen Forschungsgruppen erzeugt. Reportergene wie β-Galactosidase, β-Lactamase und Luciferase wurden in mehrere Leishmania-Spezies unter Verwendung episomaler Vektoren eingeführt und zeigen einen begrenzten Nutzen für das Wirkstoff-Screening in extra- und intrazellulären Formen des Parasiten 10,11,12,13,14,15. Diese Ansätze haben die Einschränkung, dass sie einen starken Selektionsdruck in der Kultur erfordern, um die Eliminierung des episomalen Konstrukts zu vermeiden, sowie die Verwendung zusätzlicher Reagenzien, um die Aktivität des Reportergens aufzudecken. Umgekehrt wurden das grün fluoreszierende Protein (GFP) und seine Variante, das verstärkte grün fluoreszierende Protein (eGFP), aufgrund ihrer Flexibilität und Sensitivität sowie der Möglichkeit, den Screening-Prozess mittels Durchflusszytometrie oder Fluorometrie zu automatisieren, bei der Generierung einer großen Anzahl transgener Leishmania-Stämme für In-vitro-Wirkstoff-Screening-Assays verwendet^{15, 16,17,18,19}. Trotz vielversprechender Ergebnisse waren die Kulturen dieser transgenen Stämme sehr heterogen in ihren Fluoreszenzwerten, da die Anzahl der Kopien des GFP-Gens nicht bei allen Parasiten gleich war. Darüber hinaus erforderte die Aufrechterhaltung der Fluoreszenz einen konstanten Selektionsdruck auf die Parasiten in der Kultur, da das GFP-Gen in einem episomalen Konstrukt eingeführt wurde.

Aus den oben genannten Gründen haben sich viele Bemühungen auf die Entwicklung neuer Methoden zur Herstellung stabiler rekombinanter Stämme konzentriert. Diese Bemühungen stützten sich hauptsächlich auf die Integration von Reportergenen in ribosomale Loci, wobei die höheren Transkriptionsraten ribosomaler Gene genutzt wurden²⁰. Es wurden Stämme von L. infantum und L. amazonensis erzeugt, die die Gene integriert haben, die für β-Galactocidase²¹, IFP 1.4, iRFP²² und tdTomato²³ kodieren, und sie wurden auf ihre Nützlichkeit in Wirkstoff-Screening-Assays untersucht. Verschiedene Gruppen haben L. donovani-Stämme entwickelt, die GFP konstitutiv exprimieren, indem sie ihr kodierendes Gen durch homologe Rekombination in den ribosomalen RNA-Locus 18S (ssu-Locus) integrieren^24,25; Sie zeigten eine stabile und homogene GFP-Expression in der transfizierten Population, einschließlich intrazellulärer Amastigoten 24,25, und sie wurden erfolgreich in Wirkstoff-Screening-Assays implementiert^24,25,26. Bolhassani et ^al.27 entwickelten Stämme von L. major und L. infantum, die GFP als integriertes Transgen exprimieren. Sie verwendeten den Integrationsvektor pLEXSY, der ursprünglich für die transgene Expression von Proteinen in einem System mit L. tarentolae als Wirt entwickelt wurde²⁸. Der pLEXSY-GFP-Vektor hat sich als sehr effizient für die Generierung verschiedener Leishmania-Stämme erwiesen, die GFP 24,25,27,29,30 konstitutiv exprimieren. Bei diesen Parasiten ist die Fluoreszenz homogen und bleibt in den intrazellulären Formen erhalten, so dass sie in Fußballenläsionen infizierter Mäuse nachgewiesen werden^{kann 27}.

In dieser Arbeit beschreiben wir die Methodik, die zur Generierung von L. panamensis – und L. donovani-Stämmen verwendet wird, die das für eGFP kodierende Gen als integriertes Transgen unter Verwendung des pLEXSY-Systems exprimieren. Die durch diesen Prozess erzeugten Stämme werden in unserem Labor für die Durchführung von Medikamenten-Screening-Assays verwendet, die die potenzielle Anti-Leishmanie-Aktivität von Molekülen natürlichen und synthetischen Ursprungs bewerten.