Ontwikkeling van Leishmania-soortenstammen met constitutieve expressie van eGFP

Protozoaire parasieten van het geslacht Leishmania veroorzaken leishmaniasis, een ziekte met een breed scala aan klinische manifestaties. Deze ziekte komt voor in 98 landen en de jaarlijkse incidentie wordt geschat op 0,9 tot 1,6 miljoen gevallen¹. Leishmania-soorten die pathogeen zijn voor de mens zijn verdeeld in twee subgenera, namelijk L. (Leishmania) en L. (Viannia). Infectie met sommige soorten die tot de L behoren. (Leishmania) subgenus, zoals L. donovani en L. infantum, kan leiden tot viscerale leishmaniasis (VL), die fataal is als het onbehandeld blijft². Soorten die behoren tot de L. (Viannia) subgenus zijn geassocieerd met de meeste gevallen van cutane leishmaniasis (CL) en mucocutane leishmaniasis (MCL) in Midden- en Zuid-Amerika, met name in Panama, Colombia en Costa Rica, waarbij L. panamensis de belangrijkste etiologische verwekker is van deze klinische presentaties ^3,4.

Bestaande anti-leishmania chemotherapie die geneesmiddelen zoals pentavalente antimonialen, miltefosine en amfotericine B omvat, is zeer giftig en duur. Bovendien is de toegenomen resistentie tegen geneesmiddelen in de afgelopen decennia toegevoegd aan de factoren die de effectieve behandeling van patiënten wereldwijd verstoren⁵. Er zijn aanzienlijke verschillen aangetoond tussen soorten van het geslacht Leishmania met betrekking tot de gevoeligheid voor geneesmiddelen, met name tussen nieuwe en oude wereldsoorten ^6,7. Om deze redenen is het noodzakelijk om de inspanningen te richten op de identificatie en ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen tegen leishmania, met speciale aandacht voor soortspecifieke benaderingen. Het bestuderen van grote bibliotheken van kandidaat-geneesmiddelen met traditionele methodologieën is vrij moeilijk, aangezien deze methodologieën zeer arbeidsintensief zijn voor het evalueren van de activiteit van verbindingen tegen intracellulaire amastigoten of voor het uitvoeren van in vivo experimenten⁸; Daarom was het noodzakelijk om nieuwe technieken te ontwikkelen die deze nadelen verminderen, waaronder de implementatie van reportergenen en de ontwikkeling van fenotypische screeningstests met een hoog gehalte⁹.

Het gebruik van reportergenen heeft het potentieel aangetoond om de efficiëntie van het screeningproces van geneesmiddelen te verhogen, omdat het de ontwikkeling van high-throughput en in vivo assays vergemakkelijkt. Recombinante Leishmania-parasieten die verschillende reportergenen tot expressie brengen, zijn gegenereerd door verschillende onderzoeksgroepen. Reportergenen, zoals β-galactosidase, β-lactamase en luciferase, zijn geïntroduceerd in verschillende Leishmania-soorten met behulp van episomale vectoren, wat een beperkt nut aantoont voor geneesmiddelenscreening in extra- en intracellulaire vormen van de parasiet 10,11,12,13,14,15. Deze benaderingen hebben de beperking van het vereisen van een sterke selectieve druk in cultuur om de eliminatie van het episomale construct te voorkomen, evenals het gebruik van extra reagentia om de activiteit van het reportergen te onthullen. Omgekeerd zijn het groene fluorescerende eiwit (GFP) en zijn variant, het verbeterde groene fluorescerende eiwit (eGFP), gebruikt bij het genereren van een groot aantal transgene Leishmania-stammen voor in vitro screeningtests voor geneesmiddelen vanwege hun flexibiliteit en gevoeligheid, evenals de mogelijkheid om het screeningsproces te automatiseren met behulp van flowcytometrie of fluorometrie^{15, 16,17,18,19}. Ondanks veelbelovende resultaten waren culturen van deze transgene stammen zeer heterogeen in hun fluorescentieniveaus, omdat het aantal kopieën van het GFP-gen niet bij alle parasieten hetzelfde was. Bovendien vereiste het handhaven van fluorescentie een constante selectieve druk op de parasieten in cultuur, omdat het GFP-gen werd geïntroduceerd in een episomale constructie.

Om de eerder genoemde redenen zijn veel inspanningen gericht op het ontwikkelen van nieuwe methoden voor het produceren van stabiele recombinante stammen. Deze inspanningen zijn meestal gebaseerd op de integratie van reportergenen in ribosomale loci, waarbij gebruik werd gemaakt van de hogere transcriptiesnelheden van ribosomale genen²⁰. Stammen van L. infantum en L. amazonensis zijn gegenereerd met de integratie van de genen die coderen voor β-galactocidase 21, IFP 1.4, iRFP 22 en tdTomato ²³, en ze zijn geëvalueerd op hun bruikbaarheid in medicijnscreeningtests. Verschillende groepen hebben L. donovani-stammen ontwikkeld die GFP constitutief tot expressie brengen door het coderende gen te integreren in de 18S ribosomale RNA-locus (ssu locus) door homologe recombinatie^24,25; ze vertoonden stabiele en homogene GFP-expressie in de getransfecteerde populatie, waaronder intracellulaire amastigoten 24,25, en ze werden met succes geïmplementeerd in medicijnscreeningstests^24,25,26. Bolhassani et ^al.27 ontwikkelden stammen van L. major en L. infantum die GFP tot expressie brachten als een geïntegreerd transgen. Ze gebruikten de integratievector pLEXSY, oorspronkelijk ontworpen voor de transgene expressie van eiwitten in een systeem met L. tarentolae als gastheer²⁸. De pLEXSY-GFP-vector is zeer efficiënt gebleken voor het genereren van verschillende Leishmania-stammen die constitutief GFP 24,25,27,29,30 tot expressie brengen. Bij deze parasieten is fluorescentie homogeen en wordt het gehandhaafd in de intracellulaire vormen, waardoor het kan worden gedetecteerd in voetzoollaesies van geïnfecteerde muizen²⁷.

In dit werk beschrijven we de methodologie die wordt gebruikt voor het genereren van L. panamensis – en L. donovani-stammen die het gen dat codeert voor eGFP tot expressie brengen als een geïntegreerd transgen met behulp van het pLEXSY-systeem. De stammen die door dit proces worden gegenereerd, worden in ons laboratorium gebruikt voor het uitvoeren van medicijnscreeningstests die de potentiële anti-leishmania-activiteit van moleculen van natuurlijke en synthetische oorsprong evalueren.