Fotokontrollü Biyolojik Olarak Aktif Bileşiklerin İn Vitro ve İn Vito Değerlendirilmesi - Kanser Fotofarmakolojisi için Potansiyel İlaç Adayları

Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler, laboratuvar hayvanlarını içeren araştırma projelerinin yürütülmesine yönelik yerel ve uluslararası düzenlemelere (Ukrayna “Hayvanların Zulümden Korunmasına İlişkin Kanun”, deneysel ve diğer bilimsel amaçlar için kullanılan omurgalı hayvanların korunmasına ilişkin Avrupa Sözleşmesi (Avrupa sözleşmesi, Strasburg, 1986), bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63/EU sayılı Direktif) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma Bienta firmasının Biyoetik Komisyonu tarafından onaylanmıştır. Bu deneylerde C57BL / 6NCrl fareler (her biri yaklaşık 20 g ağırlığındaki yetişkin dişiler) kullanılmıştır. Belirli malzemeler, reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir. 1. 2D ve 3D LLC hücre kültürlerini kullanarak LMB002 (“halka kapalı” ve “halka açık” formlar) için IC50 değerlendirmesi Tamponların hazırlanması ve bileşiklerin stok çözeltileriNOT: Arabellekleri standart yordamları kullanarak hazırlayın. Alternatif olarak, piyasada satılan çözümleri kullanın.14.2 g Na 2 HPO 4,2.4 g KH2PO4, 80 g NaCl ve 2g KCl ila 1 L damıtılmış su ekleyerek 10x fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın. Otoklav 10x PBS hazırladı ve 900 mL damıtılmış suya 100 mL 10x çözelti ekleyerek 1x çözeltiye seyreltin. Ardından, çözeltiyi 4 ° C’de saklayın. 1 L damıtılmış suya 4,78 g DPBS tozu ekleyerek Dulbecco’nun PBS’sini (DPBS) hazırlayın. Tüm katı madde çözünene kadar çözeltiyi karıştırın, pH ölçüm cihazı kullanarak pH’ı kontrol edin ve 1 M NaOH veya 1 M HCl (pH 7.3-7.4) ekleyerek ayarlayın. İstenilen pH seviyesine ulaştıktan sonra, ortamı steril bir kabinde 0,22 μm’lik bir vakum filtresinden geçirin. 4 °C’de saklayın. 1 L damıtılmış suya 238,3 g HEPES ekleyerek 1 M 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) tampon çözeltisi hazırlayın. Çözeltinin pH’ını pH 7.5’e kadar 1 M NaOH ile ayarlayın. Steril bir kabinde 0,22 μm vakum filtresinden süzün. 4 °C’de saklayın. 10x çözeltisini seyrelterek 1x tripsin-EDTA (EDTA = etilendiamintetraasetik asit) çözeltisi hazırlayın. Bunu yapmak için, 50 mL’lik steril bir tüp içinde 45 mL 1x PBS çözeltisine 5 mL 10x Tripsin-EDTA ekleyin. 4 °C’de saklayın. Dulbecco’nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) bazini, karıştırma plakasına yerleştirilmiş manyetik bir karıştırma çubuğu ile bir ölçüm silindirine 13,4 g DMEM yüksek glikoz tozu ve 3,7 g Na2CO3 ila 1 L damıtılmış su ekleyerek hazırlayın. Tüm katı madde çözünene kadar çözeltiyi karıştırın, pH ölçüm cihazı kullanarak pH’ı kontrol edin ve 1 M NaOH veya 1 M HCl (pH 7.3-7.4) ekleyerek ayarlayın. İstenilen pH’a ulaştıktan sonra, ortamı steril bir kabinde 0,22 μm vakum filtresinden geçirin ve 4 ° C’de saklayın. 900 mL DMEM baziğine 100 mL fetal sığır serumu (FBS), 10 mL penisilin-streptomisin çözeltisi, 10 mL L-glutamin çözeltisi ve 10 mL 1 M HEPES tamponu ekleyerek DMEM komple ortamını hazırlayın. 4 °C’de saklayın. Test bileşikleri için stok çözeltileri hazırlayın.Her bileşik için, halka kapalı fotoformda iki adet 5.12 mg’lık (örneğin, LMB002) partiyi, iki adet 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne (biri berrak ve diğeri siyah şeffaf olmayan duvarlarla) tartın. Ekstra berrak bir duvar tüpünde 2,28 mg pozitif kontrol (örneğin, gramicidin S) tartın. Her numuneye 100 μL saf DMSO ve 30 s boyunca vorteks ekleyin. Şeffaf duvar tüpündeki stok çözeltisini (LMB002) “halka kapalı” formdan “halka açık” forma kadar fotoizomerize ederek, çözeltiyi 660 nm lazer (ışık gücü yoğunluğu 0,6 W /cm2) ile vorteksleme ile ışınlayarak iyice karıştırmayı sağlayın. Renk gözle görülür şekilde koyu mordan açık kahverengiye değişene kadar devam edin. Alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun. 2D hücre kültürü deneyi-hücrelerin tohumlanması (1. gün)DMEM komple ortamının 10 mL’sini bir LLC hücre kültürüne sahip T-75 şişesinden 15 mL’lik steril bir tüpe aktarın. Kalan ortamı bir vakum pompası ile aspire edin. Hücre kültürünü 5 mL 1x DPBS ile yıkayın ve çözeltiyi bir vakum pompasıyla aspire edin. Hücreleri 3 mL 1x tripsin-EDTA çözeltisi ile örtün ve şişeyi% 5 CO 2 atmosferinde 37 ° C’de2-3 dakika inkübe edin. 1x tripsin-EDTA çözeltisi içeren hücre kültürü şişesine 6 mL DMEM ortamı (daha önce steril bir tüpe aktarılmış) ekleyerek ve hücreleri hücre kültürü şişesi duvarlarından yıkamak için süspansiyonu birkaç kez pipetleyerek tripsin etkisini durdurun. Süspansiyonu 15 mL’lik bir tüpe aktarın ve 4 dakika boyunca 200 × g’da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı bir vakum pompasıyla aspire edin. Tüpün altındaki hücre peletine dokunmaktan kaçının. 2 mL taze DMEM tam ortam ekleyerek ve birkaç kez pipetleyerek hücreleri yeniden askıya alın. Süspansiyonun yaklaşık 15 μL’sini 0,5 mL’lik bir tüpe örnekleyerek, 15 μL’den% 0,4 tripan mavisi ekleyerek ve elde edilen karışımı bir hücre sayım odasına aktararak hücreleri sayın. Saydıktan sonra, zaman noktası başına 25 mL hücre süspansiyonu hazırlayın. Tohum 5.000-10.000 (ortalama 8.000) LLC hücresi / kuyusu, şeffaf tabanlı ve siyah şeffaf olmayan duvarlara sahip 96 delikli bir plakanın merkezi 60 kuyusunda 200 μL DMEM içinde. Kalan 36 kuyuyu saf DMEM ile doldurun. Plakaları gece boyunca 37 ° C ve% 5 CO2’de bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Alt plakanın eşit olmayan şekilde ısınmasını önlemek için altında plastik plaka kapakları kullanın. 2D hücre kültürü deneyi – bileşiklerin eklenmesi (2. gün)Hücreler% 70-80 akıcılığa ulaşana kadar plakalardaki ışık mikroskobu ile hücreleri izleyin. Ortamı steril bir kabinde bir vakum pompası ile kuyulardan aspire edin. Taze önceden ısıtılmış DMEM ortamından 100 μL ekleyin ve plakaları bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Test bileşiklerinin seri seyreltilerini hazırlayın ve polipropilen otoklavlanmış şeffaf plakalarda pozitif kontrol. Bireysel zaman noktası ölçümleri için aşağıdaki çözümleri yapın:NOT: DMSO’daki stoklarla başlayın ve DMEM ile seyreltin, ancak son en yüksek konsantrasyonda DMSO’nun% 1 v / v’sini aşmayın.128 μM’lik bir gramicidin S çözeltisi elde etmek için, 198,7 μL DMEM’ye 1,3 μL 20 mM stok çözeltisi ekleyin. LMB002’nin 256 μM’lik bir çözeltisini, “halka açık” formu elde etmek için, 198,7 μL DMEM’e 1,3 μL 40 mM çözelti ekleyin. LMB002’nin 512 μM’lik bir çözeltisini, “halka kapalı” formu elde etmek için, 197,4 μL DMEM’e 2,6 μL 40 mM stok çözeltisi ekleyin. Her konsantrasyon noktasından dört set elde etmek için üç ek tekrar gerçekleştirin. Her başlangıç kuyucuğundan 100 μL aspire ederek, 100 μL DMEM ile bir kuyuya aktararak ve iyice karıştırarak bir çift seyreltme serisi hazırlayın.NOT: Foto-değiştirilebilir bileşiklerle çalışmak, geri fotoizomerizasyonu önlemek için aydınlatma ayarı gerektirir. Steril dolaplarda ışığın kapatılması önerilir. Bileşiklerin kuyucuklardaki (5-150 μM) nihai konsantrasyonlarını, hazırlanan çözeltilerin 100 μL’sini her seferinde 56 kuyucukta 100 μL önceden eklenmiş DMEM ile aktararak elde edin. Negatif bir kontrol görevi görmek için dört kuyucuğa her seferinde 100 μL DMEM ekleyin. Kontrolsüz foto geçişi önlemek için alüminyum folyo veya plastik koruyucu şeffaf olmayan kapaklı kapak plakaları. Plakaları, seçilen inkübasyon süresi (10 dakika, 60 dakika, 24 saat veya 72 saat) için 37 ° C’de (ekstra plastik plaka kapaklarının altına kullanarak) bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. 2D hücre kültürü deneyi – boyama ve görüntüleme (2-5. günler)Farklı dönemlerde bileşiklerle inkübasyondan sonra, 10 ve 60 dakika boyunca bileşiklerle inkübe edilen plakalara kuyucuk başına 50 μL boyama çözeltisi ekleyin. Plakaları 37 ° C’de 20 dakika boyunca inkübe edin.NOT: 5.810 μL steril olmayan 1x PBS’ye 8 μL 20 mM Hoechst 33342 çözeltisi (nihai konsantrasyon 5 μM), 32,5 μL 1 mM propidyum iyodür (PI) çözeltisi (nihai konsantrasyon 1 μM) ve 650 μL steril olmayan FBS ekleyerek zaman noktası başına stok boyama çözeltileri hazırlayın. Hücrelerin sıcaklık şoku yaşamasını önlemek için FBS ve PBS’yi 37 ° C’de bir su banyosunda önceden ısıtın. 20x objektif lens kullanarak otomatik floresan görüntüleme gerçekleştirin. Aynı boyama ve görüntüleme prosedürünü (adım 1.4.1 -1.4.2), 24 (gün 3) ve 72 (gün 5) saat boyunca bileşiklerle inkübe edilen plakalar için tekrarlayın.NOT: Tipik 2B plaka haritaları Şekil 2’de gösterilmiştir. 3D hücre kültürü deneyi – hücrelerin tohumlanması (1. gün)NOT: Bu bölümdeki adımlar, hücre kültürünün 2B deney hazırlığı, test edilen bileşiklerle inkübasyon ve görüntüleme (adım 1.1-1.4) için açıklananlarla aynıdır. Bununla birlikte, bu durumda, hücreler siyah, şeffaf olmayan duvarlara sahip 384 kuyucuklu ultra düşük yapışma U-taban plakasında kompakt olgun sferoidler olarak hazırlanır. Bu büyüklükte bir plaka kullanmak, bir deneyde iki bileşiğin karşılaştırılmasına izin verir.Bir LLC hücre kültürü ile 2D deney protokolünden 1.2.1-1.2.9 adımlarını tekrarlayın. Hücreleri saydıktan sonra, hücre süspansiyonunun 25 mL’sini hazırlayın. Tüm kuyucuklarda kuyucuk başına 1.000 hücreyi 50 μL DMEM içinde 384 kuyucuklu, düşük bağlayıcılı, U-tabanlı bir plakada tohumlayın. 30 s boyunca 40 × g’da santrifüj yapın ve hücreleri kuyucukların duvarlarından tabana doğru sallamak için 1 dakika boyunca 250 rpm’de bir plaka çalkalayıcı ile çalkalayın. Plaka tabanının 48 saat boyunca eşit olmayan şekilde ısınmasını önlemek için plakaları 37 ° C’de bir inkübatöre ve% 5 CO2’de ekstra plastik plaka kapaklarının üzerine yerleştirin. 3D hücre kültürü deneyi – bileşiklerin eklenmesi (3. gün)Kompakt olgun sferoidlerin oluştuğundan emin olmak için plakalardaki hücreleri mikroskopi ile izleyin. İncelenen bileşiklerin polipropilen otoklavlanmış şeffaf plakalarda seri seyreltilmesini hazırlayın. Bu durumda, ek bir bileşik ekleyin. Bireysel zaman noktası ölçümleri için aşağıdaki çözümleri yapın:175 μM ve 350 μM gramicidin S çözeltileri elde etmek için, 198,2 μL DMEM’e 1,8 μL 20 mM stok çözeltisi ekleyin ve buna karşılık olarak 196,4 μL DMEM’e 3,6 μL stok ekleyin. LMB002’nin 175 μM ve 350 μM çözeltilerini, “halka açık” formu elde etmek için, 199 μL DMEM’e 1 μL 40 mM stok çözeltisi ekleyin ve buna karşılık olarak 198,2 μL DMEM’e 1,8 μL stok ekleyin. LMB002’nin 350 μΜ ve 1.750 μM çözeltilerini, “halka kapalı” formu elde etmek için, 198,2 μL DMEM’e 1,8 μL 40 mM stok çözeltisi ekleyin ve buna karşılık olarak 191,2 μL DMEM’e 8,8 μL stok ekleyin. Her konsantrasyon noktasından dört set elde etmek için üç ek çoğaltma gerçekleştirin. Her başlangıç kuyusundan 20 μL çekerek, 180 μL DMEM ile kuyuya aktararak ve iyice karıştırarak seri seyreltmeler elde edin.NOT: Foto-değiştirilebilir bileşiklerle çalışmak, geri fotoizomerizasyonu önlemek için aydınlatma ayarı gerektirir. Steril dolaplardaki ışıkların kapatılması önerilir. 50 μL DMEM içeren 128 kuyucukta her seferinde hazırlanan çözeltilerin 20 μL’sini transfer ederek kuyulardaki bileşiklerin nihai konsantrasyonlarını elde edin. Kontrol görevi görmesi için her seferinde üç kuyucuğa 20 μL DMEM ekleyin. Fotoanahtarlamayı veya buharlaşmayı önlemek için plakaları alüminyum folyo veya plastik koruyucu kaplama ile örtün. Plakaları, seçilen inkübasyon süresi için plastik plaka kapakları üzerindeki bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. 3D hücre kültürü deneyi – boyama ve görüntüleme (3-6. günler)13 μL 1 mM kalsein çözeltisi (nihai konsantrasyon 1 μM), 22 μL 20 mM Hoechst 33342 çözeltisi (nihai konsantrasyon 33 μM), 40 μL 1 mM PI çözeltisi (nihai konsantrasyon 3 μM), 300 μL steril olmayan FBS ila 2.625 μL steril olmayan 1x PBS ekleyerek zaman noktası başına boyama çözeltisini hazırlayın. Hücrelerin sıcaklık şoku yaşamasını önlemek için FBS ve PBS’yi 37 ° C’de bir su banyosunda önceden ısıtın. Bileşiklerle farklı periyotlarda inkübasyondan sonra, 10 dakika boyunca bileşiklerle inkübe edilen kuyucuklara kuyu başına 20 μL boyama çözeltisi ekleyin. 2 saat boyunca 37 ° C’de inkübe edin. 20x objektif lens kullanarak floresan konfokal görüntüleme gerçekleştirin. Aynı boyama ve görüntüleme prosedürünü, 24 (gün 4) ve 72 (gün 6) saat boyunca bileşiklerle inkübe edilen kuyucuklar için tekrarlayın.NOT: Bu deneyde, kalsein, çok renkli boyama çözeltisinin üçüncü bir bileşeni olarak kullanılmıştır. 2D ve 3D deneylerden elde edilen görüntüler, cihazın otomatik görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir. Hoechst ve propidium iyodür boyaları ile birlikte boyanan hücreler nekrotik olarak ölü kabul edilir ve konsantrasyonun bir fonksiyonu olarak fraksiyonları IC50 değerini hesaplamak için kullanılır. Şekil 2: 2B kültür deneyleri için tipik plaka haritaları örneği. Bileşikler ve kontrol için renk kodları belirtilmiştir. Test edilen bileşiklerin konsantrasyonları (kuyucukların içindeki sayılar) μM cinsinden verilir . Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. 2. Bir doku vekilinde fotoanahtarlama etkinliğinin belirlenmesi Örnek ışınlama için optik treni Şekil 3’te gösterildiği gibi monte edin (lazer ışık kaynağından bir optik kablo, değişken odak uzaklığına sahip bir lens, şeffaf olmayan kapaklı bir şırınga ve düz bir kesim ucundan oluşur).Odak uzaklığını ve lensin diyafram açıklığını değiştirerek, kullanılan şırınganın iç çapından 1-1,5 mm daha büyük bir çapa sahip, ancak yine de mümkün olduğunca diyafram açıklığı içinde olan düz bir ışık demeti elde edin. Kesilmiş ucu ve iç çapı 12,4 mm olan ve şeffaf olmayan plastik bir kapakla kaplanmış 5 mL’lik bir şırınga kullanın. 200 mW’lık bir lazer güç çıkışında, optik sistemin çıkışındaki güç yoğunluğunu bir fotometre ile ölçüldüğü gibi ~ 103 mW /cm2 olarak ayarlayın.NOT: Sonraki tüm işlemler, mümkün olan en az işyeri aydınlatması ile karanlık bir odada yapılmalıdır. PBS’de 1 mg/mL konsantrasyonda 3 mL LMB002 (“halka kapalı” form) stok çözeltisi hazırlayın. Plastik bir kapta LMB002’nin inaktif fotoformu ile yüklenmiş bir model doku örneği hazırlayın. Tipik bir çalışmada, 5 g taze kıyılmış domuz eti, numunedeki 50 mg / kg’lık nihai konsantrasyona ve ~ 9/1 (v / v) doku / PBS oranına ulaşmak için 277 μL LMB002 stok çözeltisi ve 260 μL PBS ile mekanik olarak karıştırılır. Şırıngayı hazırlanan numune ile doldurun, içeride hava kabarcığı olmadığından emin olun ve pozlama (kesim) ucunda düz bir yüzey oluşturun.NOT: Şırıngadaki numunenin silindiri eksen boyunca ~ 40 mm işgal etmelidir. Numuneyi optik trende Şekil 3’te gösterildiği gibi ~60 J/cm2 pozlamaya karşılık gelen 9 dakika 44 sn boyunca ışınlayın. Maruz kaldıktan sonra numunenin 4 mm kalınlığında dilimlerini, pistonu kullanarak şırıngadan iterek ve bir neşterle keserek hazırlayın. Dilimleri tartın ve ayrı test tüplerine yerleştirin ve ışınlanmış yüzeyden ortalama mesafeye (mm) göre işaretleyin. Test tüplerinde iki kontrol numunesi (optimal miktar, 0,5-0,7 g) hazırlayın: birinde,% 10 (hacim) PBS (54 μL) ile karıştırılmış kıyılmış et ve diğerinde, adım 2.4’te elde edilen model doku örneği, tüm LMB002 “halka kapalı” moleküllerin “halka açık” forma dönüştürülmesini sağlamak için 10 dakika boyunca 500 mW lazer ışığı ile ışınlanmıştır. Her dilime ve kontrol numunelerine asetonitril-su karışımı (/ v/v, %0,01 trifloroasetik asit (TFA), 1,4 mL/g) ekleyin. İçeriği bir cam çubuk kullanarak iyice karıştırın. Oda sıcaklığında en az 10 dakika inkübe edin ve çözünmeyen malzemeyi çıkarmak ve süpernatanı toplamak için karışımları 20 dakika boyunca 5220 x g’de santrifüj veya 30 dakika boyunca 20 x g’de santrifüjü iki kez santrifüj edin. Süpernatantları (~ 0.7 mL) dikkatlice toplayın ve 30 dakika boyunca 16.000 x g’de tekrar santrifüj edin. Süpernatantları (her biri ~ 0,5 mL) toplayın ve analitik bir C18 sütunu, %3,46 B/dak doğrusal A:B gradyanı, 2,0 mL/dak akış hızı ve 100 μL enjekte edilen hacim ile ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (RP HPLC) ile analiz edin. UV tarafından algılanan kromatogramları 570 nm’de (“halka kapalı” formun algılanması) ve 270 nm’de (“halka açık” formun algılanması) kaydedin. Her iki fotoformun (elüent A: sulu% 0.1 TFA; elüent B: % 90 asetonitril-su,% 0,1 TFA) spesifik tutma sürelerini belirlemek için ışınlanmamış (adım 2.4) ve ışınlanmış kontrol (adım 2.8) numunelerini kullanın ve yöntemi kalibre edin. Bilinen konsantrasyonlardaki LMB002 çözeltilerinin kromatogramlarını alarak ve analiz ederek elde edilen kalibrasyon eğrilerini kullanarak analiz edilen numunelerdeki LMB002 fotoformlarının gerçek miktarlarını belirleyin. Kalibrasyon için, 100 μL (enjekte edilen hacim) başına 0,36, 0,9 ve 3,6 μg elde etmek için stok çözeltisini (adım 2.3) asetonitril-su karışımı (% 0.01 TFA ile desteklenmiş% 70/% 30 v / v) ile seyrelterek LMB002 “halka kapalı” çözeltileri hazırlayın; Elüent gradyanı ve akış hızı, adım 2.12’deki ile aynıdır. Deneyi (adım 2.4-2.12) üç kez tekrarlayın ve grafikteki her fotoformun normalleştirilmiş yüzdesini (yüzde) mesafeye (ışınlanmış doku yüzeyinden) karşı çizin. İstatistikleri hesaplayın (yani, her konsantrasyon noktasındaki standart sapma). Şekil 3: Model dokuda fotokonversiyonun etkinliğini belirlemek için deneysel düzenek. (A) Şematik ve (B) fotoğraf; 1, lazer ışık kaynağından optik kablo; 2, değişken odak uzaklığına sahip lens; ve 3, et kıyması-LMB002-fosfat tamponlu salin karışımı 4’e yerleştirilir, şeffaf olmayan bir örtüye ve kesilmiş ön uca sahip bir şırınga (kapaksız (B) ‘de gösterilmiştir). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. 3. İn vivo antikanser etkinlik tayini NOT: Deneme zamanlaması ve uç noktaları Şekil 4’te gösterilmiştir. Arıtma sonrası dönemde hayvan bakım standartları 3R kurallarına uygun olmalıdır – barınak uygun kafes yoğunluğu ve kaynak kullanılabilirliğini içermelidir. Mümkün olduğunda, tünel veya hacamat gibi rahatsız edici olmayan hayvan taşıma yöntemlerine uyun. Şekil 4: İn vivo terapötik deney için zamanlama. Deney gruplarının tanımı, tedavi detayları, sonlanım noktaları ve postmortem analiz programları. Kısaltmalar: LLC = Lewis akciğer karsinomu; IV = intravenöz; SC = deri altı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Subkutan aşılama için kanser hücrelerinin hazırlanması (gün 0).LLC hücrelerini DMEM’de (4.5 g / L glikoz) % 10 FBS, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile 37 ° C’de ve% 5 CO2’de geçirin. Hücreleri% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi, santrifüj kullanarak toplayın ve serumsuz DMEM’de askıya alın. Hücreleri sayın ve bir hemositometre ve tripan mavisi dışlama testi kullanarak canlılıklarını belirleyin. DMEM ve Matrigel karışımında (1:1) konsantrasyon 10 ×10 6 hücre/mL konsantrasyonda son hücre süspansiyonunu hazırlayın. Enjeksiyondan önce süspansiyonu buz üzerinde tutun. LLC hücre aşılaması (gün 0)Yetişkin dişi C57BL/6NCrl fareyi (~20 g ağırlığında) izofluran anestezi makinesinin indüksiyon odasına yerleştirin. İzoflurane% 5’inde sedasyon yapın ve hayvan tamamen bilinçsiz olana kadar bekleyin. Tıraş ederek kürkü hücre aşılama alanından çıkarın. 5 × 105 LLC hücrelerini ~ 100 μL DMEM’de aşılayın: Matrigel (1: 1) karışımı sağ arka bacağa.NOT: Mümkün olduğunda, tek iğne kullanımı uygulamasına uyun. Bileşik uygulaması ve fotoışınlamaNOT: Aşılamadan sonraki 5-8 gün içinde, tümörleri palpe edilebilir olduğunda ve ~ 50-100mm3 hacme ulaştığında hayvanlar tedaviye hazırdır. LMB002 ve bu bileşik tarafından işlenen fareler ile yarı karanlık koşullar altında (işyerinden en az 5 m uzaklıkta bir adet 4 W LED lamba) sonraki tüm işlemleri gerçekleştirin.Koyu mavi homojen çözeltiler elde etmek için LMB002’yi (“halka kapalı” form) steril fizyolojik salin içinde 5 mg/kg (IV) dozunda 1 mg/mL konsantrasyonda çözün. Işınlamadan önce, sekiz hayvandan oluşan dört grubu rastgele bir araya getirin ve tıraş ederek kürkü tümörden ve yakındaki bölgelerden çıkarın. IV enjeksiyonları için tutucuya bir fare yerleştirin ve kuyruk damarını görünür kılmak için hayvanın kuyruğunu 37 ° C’de bir su banyosunda önceden ısıtın.NOT: Preoperatif analjezi düşünün. Bileşiği kuyruk damarına 5 mL / kg’da enjekte edin. İki kontrol grubu için, hayvan başına 100 μL salin (intravenöz olarak) enjekte edin (20 g vücut ağırlığı). İki deney grubundaki hayvanların test edilen bileşiği inaktif fotoformda (salin içinde 1 mg / mL) aldıklarından emin olun.NOT: Mümkün olduğunda, tek iğne kullanımı uygulamasına uyun. Daha sonra, bileşiğin enjeksiyonundan 2 saat 45 dakika sonra, fareyi anestezi altına alın. Oksijende% 3-4 izofluran ile sedasyonu indükleyin. Oksijende% 0.5 -% 1 izofluran ile 15 dakika boyunca anestezi uygulayın. Fareyi, yalnızca tümör bölgesini ışığa maruz bırakan bir deliğe sahip siyah bir maske ile örtün. Lazer diyot modülünü 650 nm lazerle açın ve kırmızı lazerin gücünü 200 mW’a ve mavi / UV kılavuz lazerini 2 mW’a ayarlayın.NOT: Lazer cihazı açıkken mavi koruyucu gözlük kullanın. Kırmızı lazerden gelen ışık akısını (farelerden uzakta) bir fotometre ile ölçün ve ışık akısının 100 mW /cm2 olduğu optik kablodan olan mesafeyi belirleyin. Işık kaynağının tümörden belirlenen mesafede olduğundan ve ışığın tüm tümör alanını kapladığından emin olmak için kabloyu bir standa sabitleyin. Bu işlem sırasında mavi / UV kılavuz lazer ışığı kullanın. Tümör bölgesini 20 dakika boyunca ışınlamak için kırmızı lazeri açın. Işınlamadan sonra, izofluran akışını kapatın, hayvanı kafesine geri döndürün ve önümüzdeki 30 dakika boyunca durumunu dikkatlice gözlemleyin.NOT: Bileşik uygulamadan sonra, fareleri 2 gün boyunca karanlıkta tutun. Sadece ışık-gün döngüsü değiştirilmelidir; Diğer tüm barınma koşulları değişmeden kalmalıdır. Tedavi sonrası gözlemlerHayvanları günlük olarak gözlemleyin ve tümörlerinin ağırlığını ve boyutlarını ölçün. Tümör hacmini ölçün ve nekrozun ilerlemesini not edin.NOT: Arıtma sonrası dönemde hayvan bakım standartları 3R kurallarına uygun olmalıdır – barınak uygun kafes yoğunluğunu ve kaynak kullanılabilirliğini içermelidir. Mortaliteyi değerlendirmek için önceki adımda toplanan verileri kullanın. Standart prosedürü kullanarak hayatta kalma oranını belirleyin.NOT: Ciddi klinik bulgular ortaya çıkarken (vücut ağırlığı kaybı% 15’ten fazla vücut ağırlığı kaybı, tümör ülserasyonu 7 gün içinde iyileşmez ve seslendirme) veya tümör hacmi 2.500mm3’e ulaşır ulaşmaz hayvanlar kurban edilmeli ve ölü sayılmalıdır.