<em>In Vitro</em> and <em>In Vivo</em> Evaluation of Photocontrolled Biologically Active Compounds - Potential Drug Candidates for Cancer Photopharmacology

Kateryna Horbatok; Tetyana Makhnii; Viktoriia Kosach; Volodymyr Danko; Andrey Kovalenko; Stanislav Fatiushchenkov; Petro Borysko; Iryna Pishel; Oleg Babii; Anne S. Ulrich; Tim Schober; Sergii Afonin; Igor  V. Komarov

doi:10.3791/64902

JoVE Journal > Chemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Chemistry

הערכה חוץ גופית ו-in vivo של תרכובות פעילות ביולוגיות מבוקרות - תרופות מועמדות פוטנציאליות לפוטופרמקולוגיה של סרטן

Published: September 29, 2023

doi:

10.3791/64902

Kateryna Horbatok*^1,2, Tetyana Makhnii*², Viktoriia Kosach², Volodymyr Danko¹, Andrey Kovalenko¹, Stanislav Fatiushchenkov¹, Petro Borysko², Iryna Pishel², Oleg Babii^3,4, Anne S. Ulrich³, Tim Schober⁴, Sergii Afonin³, Igor V. Komarov^1,2,4

¹Taras Shevchenko National University of Kyiv, ²Bienta/Enamine, ³Karlsruhe Institute of Technology, ⁴Lumobiotics

Summary

פרוטוקול זה מציג סדרה של ניסויים שאומצו להערכת פפטידים אנטי-סרטניים הניתנים להחלפה, שניתן להשתמש בהם בסינון פרה-קליני של תרכובות כאלה. זה כולל הערכת ציטוטוקסיות בתרביות תאים דו-ממדיות ותלת-ממדיות, הערכת יעילות פוטואיזומריזציה של רקמת מודל (ex vivo) ויעילות in vivo .

Abstract

תרכובות פוטו-מבוקרות ופעילות ביולוגית הן קבוצה מתפתחת של תרופות “חכמות” מועמדות. הם מספקים בטיחות נוספת בכימותרפיה מערכתית בשל ההפעלה המרחבית-זמנית המדויקת שלהם על ידי הכוונת אור שפיר ובלתי מיינן למיקום מסוים בגוף המטופל. מאמר זה מציג סדרה של שיטות להערכת העוצמה במבחנה ויעילות ex vivo של פוטואקטיבציה של תרכובות ביולוגיות מבוקרות פוטו, כמו גם את יעילות in vivo בשלבים מוקדמים של פיתוח תרופות. המתודולוגיה מיושמת על פפטידים ציטוטוקסיים אנטי סרטניים, כלומר, אנלוגים המכילים יומן של אנטיביוטיקה ידועה, gramicidin S. הניסויים מבוצעים באמצעות תרביות תאים דו-ממדיות (תאים דבקים) ותלת-ממדיות (ספרואידים) של קו תאים סרטניים (Lewis lung carcinoma, LLC), פונדקאיות רקמות חיות (בשר חזיר טחון), ומודל סרטן allograft (LLC תת-עורי) בעכברים בעלי יכולת חיסון. בחירת התרכובות היעילות ביותר ואומדן חלונות פוטותרפיים מציאותיים מבוצעים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי. יעילות הפוטואקטיבציה במשטרי תאורה משתנים נקבעת בעומקים שונים ברקמת מודל, ומינון האור האופטימלי מיושם בניסוי הטיפולי הסופי in vivo .

Introduction

תרכובות ביולוגיות פעילות פוטו-מבוקרות התגלו בעשורים האחרונים כמרכיב מבטיח של כימותרפיה בטוחה למחלות אנושיות ולמיגור ספציפי של גידולים מוצקים ממאירים¹. תרכובות אלה מכילות מקטעים פוטואיזומריזיים הפיכים (פוטו-מתגים מולקולריים) ויכולות לעבור בין פוטואיזומרים לא פעילים ופעילים בעת הקרנה באורכי גל שונים.

בהשוואה לאנלוגים הבלתי נשלטים שלהם, תרופות מבוקרות אור עשויות להיות בטוחות יותר מכיוון שניתן להחדיר אותן באופן מערכתי לגוף המטופל בצורות פחות פעילות ולמעשה לא רעילות, ואז מופעלות על ידי אור רק במידת הצורך, כגון בגידולים, כיבים ופצעים. למרות שניתן למצוא הדגמות מלהיבות מרובות של אבות טיפוס של תרופות מולקולריות כאלה במאמרים אקדמיים אחרונים 2,3,4,5,6,7^, תחום הפוטופרמקולוגיה הקלינית – יישום של שילובי תרופות/מכשור רפואי/מחלות מאושרים – אינו קיים. פוטופרמקולוגיה נמצאת עדיין בשלב גילוי התרופה, ומחקרים פרה-קליניים שיטתיים אינם ידועים.

רק לאחרונה הדגמנו את יתרון הבטיחות in vivo עבור כמה פפטידים אנטי-סרטניים מבוקרים, כלומר, האנלוגים של האנטיביוטיקה הפפטידית גרמיצדין S⁸. נגזרות פוטו-מבוקרות אלה מכילות מתג פוטו-מתג דיארילתן (DAE), אשר עובר טרנספורמציות פוטואינדוקטיביות הפיכות בין מה שמכונה פוטופורמים “פתוחים טבעתית” הנוצרים על ידי אור אדום וצורות פוטו “סגורות טבעת” שנוצרו על ידי UV (מודגמות באיור 1 עבור אחת הנגזרות, תרכובת LMB002).

איור 1: פפטיד ציטוטוקסי מבוקר לאור LMB002 והפוטואיזומריזציה שלו. קטע היומן מוצג באדום. קיצור: DAE = diarylethene. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מציאת להיטים וביצוע אופטימיזציה של פגע לליד דורשים לעתים קרובות סינון in vitro ו– in vivo של ספריות מורכבות מתאימות ^9,10. כאן, אנו מדגימים מתודולוגיה המתאימה לסינון שיטתי בתפוקה גבוהה של ציטוטוקסיות של תרכובות מבוקרות אור. אנו גם קובעים את יעילות הפוטואיזומריזציה, מעריכים את מינון האור ברקמות המודל ומעריכים את יעילות in vivo של המועמדים בעלי הביצועים הטובים ביותר. הגישה עולה בקנה אחד עם שיקולי ביו-אתיקה וטיפול בבעלי חיים.

בעבודה זו, שיטות פרה-קליניות מסורתיות משתנות כדי למנוע פוטואיזומריזציה בלתי מבוקרת של תרכובות שנבדקו. המטרה הכוללת של יישום שיטות מותאמות אלה כאן היא לפתח אסטרטגיה כללית שהיא פשוטה ומהירה ומניבה נתונים מובהקים סטטיסטית כדי להשוות באופן אמין פעילויות במבחנה ורציונליזציה של בדיקות יעילות in vivo של תרכובות פוטו-סוויץ’ לזיהוי עופרת ופיתוח נוסף.

האסטרטגיה מורכבת משלושה שלבים רצופים. השלב הראשון כולל את קביעת IC 50 (₅₀ % כדאיות תאים לכאורה) בדילולים סדרתיים עבור פוטופורמים פעילים ולא פעילים של תרכובות ביולוגיות מבוקרות אור נבחרות באמצעות תרביות תאים דו-ממדיות (דו-ממדיות, חד-שכבתיות) ותלת ממדיות (תלת-ממדיות, ספרואידיות) ומיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי בתפוקה גבוהה קונפוקלי. חלונות פוטותרפיים מושווים ביחס להפרש IC₅₀ בין שתי הפוטופורמות, ונבחרים המועמדים בעלי הביצועים הטובים ביותר. אין יתרון ספציפי בהערכת רעילות על ידי מיקרוסקופיה אוטומטית ופלטפורמות אחרות לבדיקת ציטוטוקסיות (מבחנים)¹¹; מודלים מורכבים יותר של גידולים מבוססי תאים¹² יכולים להיות מיושמים בקלות בשלב זה.

עבור התרכובות שנבחרו בשלב 1, השלב השני הוא להעריך באופן מציאותי את יעילות הפוטו-מיתוג שלהן בתוך הרקמות כפונקציה של עומק מפני השטח של הרקמה המוקרנת על ידי כימות יעילות הפוטו-מיתוג של הפוטופורמים הפחות פעילים בפונדקאית רקמה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) של תמציות דגימה מוקרן. In vivo , יעילות photoswitching ניתן ללמוד, אבל אנחנו מציעים להשתמש פונדקאית רקמות פשוטה – בשר חזיר טחון. בדקנו את תקפותה של גישה זו. מדדנו את ההמרה של התרכובות הניתנות לפוטו-סוויץ’ שלנו in vivo במודל סרטן עכברים וצפינו בערך באותה המרת אור בעומק שנמדד בניסויים קודמים עם עכברים⁸. ניתן להשתמש בכל רקמה מלאכותית חלופית^{מתאימה 13}, רקמה/איבר¹⁴ תלת-ממדיים מודפסים ביולוגית, חומרי ביופסיה או חומר פטור אחר מן החי. עם זאת, הגדרה זו היא פשרה טובה מכיוון שהיא חסכונית, מהירה ואתית.

השלב השלישי הוא קביעת יעילות אנטי-סרטנית in vivo במודל סרטן מורין. התרכובות המדגימות תכונות עליונות בניסויי המבחנה ופוטו-מיתוג יעיל בעומק של לפחות 1-1.5 ס”מ ברקמות המודל נבחרות לניסוי זה.

פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תרכובות בעלות סוגים שונים של פוטו-מתגים, בתנאי שהפוטופורמים שלהם (או המצב הפוטו-סטציונרי שלהם, PSS) יציבים למשך זמן סביר (מספר ימים או יותר). לשם המחשה, LMB002 שתואר קודם לכן נגזר DAE משמש¹⁵. צורות הפוטו LMB002 יציבות תרמית וניתן לאחסן אותן ב -20 ° C למשך שנה לפחות ללא השפלה משמעותית. תאי לואיס קרצינומה ריאתית (LLC) נבחרים עבור הדגמה זו במבחנה ו– in vivo, אך לא מוטלות מגבלות על סוג התא. תאי LLC דבקים, ניתנים לגידול בקלות בתלת-ממד, ומשמשים ליצירת גידולים (כמתואר בהפניה¹⁶). In vivo תאי LLC משמשים למדל תהליכים גרורתיים ויכולים ליצור בקלות גידולים מוצקים בעכברים בעלי יכולת חיסונית לאחר הזרקה תת עורית. מתודולוגיית in vivo זו יכולה להיות מיושמת באופן אוניברסלי על מודלים אחרים של סרטן^17,18. היישום המפורט של אסטרטגיה זו מתואר להלן.

Protocol

הטיפול בבעלי חיים וההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם לתקנות המקומיות והבינלאומיות לניהול פרויקטים מחקריים המערבים חיות מעבדה (החוק של אוקראינה “להגנה על בעלי חיים מפני אכזריות”, האמנה האירופית להגנה על בעלי חוליות המשמשים למטרות ניסוייות ומדעיות אחרות (האמנה האירופית, שטרסבורג, 1986), דירקטיבה 2010/63/EU להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות). מחקר זה אושר על ידי הוועדה לביואתיקה של חברת ביאנטה. עכברי C57BL/6NCrl (נקבות בוגרות במשקל של כ-20 גרם כל אחת) שימשו בניסויים אלה. חומרים, ריאגנטים וציוד ספציפיים מפורטים בטבלת החומרים. 1. הערכת IC50 עבור LMB002 (טפסים “סגורים טבעתית” ו”פתוחים טבעתית”) באמצעות תרביות תאים דו-ממדיות ותלת-ממדיות LLC הכנת חוצצים ופתרונות מלאי של המתחמיםהערה: הכן מאגרים באמצעות הליכים סטנדרטיים. לחלופין, השתמש בפתרונות זמינים מסחרית.הכינו 10x מלוחים חוצצי פוספט (PBS) על ידי הוספת 14.2 גרם של Na 2 HPO 4, 2.4 גרם של KH 2 PO4, 80 גרם של NaClו-2גרם של KCl עד 1 ליטר של מים מזוקקים. Autoclave הכין 10x PBS ודילל אותו לתמיסה 1x על ידי הוספת 100 מ”ל של תמיסה 10x ל 900 מ”ל של מים מזוקקים. לאחר מכן, אחסן את התמיסה ב 4 ° C. הכינו את PBS (DPBS) של Dulbecco על ידי הוספת 4.78 גרם אבקת DPBS לליטר אחד של מים מזוקקים. ערבבו את התמיסה עד שכל המוצקים מתמוססים, בדקו את רמת החומציות באמצעות מד pH וכווננו אותה על ידי הוספת 1 M NaOH או 1 M HCl (pH 7.3-7.4). לאחר ההגעה לרמת החומציות הרצויה, סננו את המדיום דרך מסנן ואקום 0.22 מיקרומטר בארון סטרילי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. הכינו תמיסת חיץ של 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) על ידי הוספת 238.3 גרם HEPES לליטר אחד של מים מזוקקים. התאם את ה- pH של התמיסה עם 1 M NaOH עד pH 7.5. סננו דרך מסנן ואקום בגודל 0.22 מיקרומטר בארון סטרילי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. הכינו תמיסת טריפסין-EDTA 1x (EDTA = חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית) על ידי דילול תמיסת 10x. לשם כך, הוסף 5 מ”ל של 10x טריפסין-EDTA ל 45 מ”ל 1x PBS פתרון בצינור סטרילי 50 מ”ל. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. הכינו את Basic Basic Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco על ידי הוספת 13.4 גרם אבקת DMEM עתירת גלוקוז ו-3.7 גרם Na2CO3 עד 1 ליטר מים מזוקקים בגליל מדידה עם מוט ערבוב מגנטי המונח על צלחת ערבוב. ערבבו את התמיסה עד שכל המוצקים מתמוססים, בדקו את רמת החומציות באמצעות מד pH וכווננו אותה על ידי הוספת 1 M NaOH או 1 M HCl (pH 7.3-7.4). לאחר ההגעה ל- pH הרצוי, סננו את המדיום דרך מסנן ואקום 0.22 מיקרומטר בארון סטרילי ואחסנו בטמפרטורה של 4°C. הכן DMEM שלם בינוני על ידי הוספת 100 מ”ל של סרום בקר עוברי (FBS), 10 מ”ל של תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, 10 מ”ל של תמיסת L-גלוטמין, ו 10 מ”ל של 1 M HEPES חיץ ל 900 מ”ל של DMEM בסיסי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. הכינו פתרונות מלאי לתרכובות הבדיקה.עבור כל תרכובת, שקלו שתי אצוות של 5.12 מ”ג (למשל, LMB002) בצורת פוטו סגורה טבעתית לשני צינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ”ל (אחד עם קירות שקופים ואחרים שחורים לא שקופים). שקלו 2.28 מ”ג של בקרה חיובית (למשל, gramicidin S) בצינור קיר שקוף במיוחד. הוסף 100 μL של DMSO טהור לכל דגימה ומערבולת למשך 30 שניות. בצע פוטואיזומריזציה של תמיסת הסטוק (LMB002) בצינור הקיר השקוף מהצורה “סגורה טבעת” לצורה “פתוחה טבעתית” על ידי הקרנת התמיסה בלייזר 660 ננומטר (צפיפות הספק אור 0.6 W/cm2) עם מערבולות כדי להבטיח ערבוב יסודי. המשיכו עד שהצבע ישתנה באופן ניכר מסגול כהה לחום בהיר. יש להגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום. ניסוי תרבית תאים דו-ממדית – זריעת התאים (יום 1)העבר 10 מ”ל של המדיום המלא DMEM מן בקבוק T-75 עם תרבית תאים LLC לצינור סטרילי 15 מ”ל. שאפו את שאריות המדיום בעזרת משאבת ואקום. לשטוף את תרבית התאים עם 5 מ”ל של 1x DPBS ולשאוף את הפתרון עם משאבת ואקום. כסו את התאים ב-3 מ”ל של תמיסת טריפסין-EDTA 1x ודגרו על הבקבוק במשך 2-3 דקות ב-37°C באטמוספירה של 5% CO2 . עצור את פעולת הטריפסין על ידי הוספת 6 מ”ל של תווך DMEM (שהועבר בעבר לצינור סטרילי) לבקבוק תרבית התאים המכיל תמיסת טריפסין-EDTA 1x ופיפטציה של התרחיף מספר פעמים כדי לשטוף את התאים מדפנות בקבוק תרבית התא. מעבירים את המתלה לצינור 15 מ”ל וצנטריפוגה ב 200 × גרם למשך 4 דקות. לאחר הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנאטנט בעזרת משאבת ואקום. הימנע מלגעת בכדורית התא בתחתית הצינור. להשעות את התאים על ידי הוספת 2 מ”ל של DMEM טרי להשלים בינוני pipetting מספר פעמים. לספור את התאים על ידי דגימה על 15 μL של התרחיף לתוך צינור 0.5 מ”ל, הוספת 15 μL של 0.4% טריפאן כחול, והעברת התערובת המתקבלת לתוך תא ספירת תאים. לאחר הספירה, להכין 25 מ”ל של השעיית התא לכל נקודת זמן. זרע 5,000-10,000 (8,000 בממוצע) LLC תאים / באר ב 200 μL של DMEM במרכז 60 בארות של צלחת 96 בארות עם תחתית שקופה וקירות שחורים לא שקופים. מלא את 36 הבארות הנותרות עם DMEM טהור. הניחו את הצלחות באינקובטור תרביות תאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2. השתמשו במכסי לוחות פלסטיק מתחת כדי למנוע חימום לא אחיד של הצלחת התחתונה. ניסוי תרבית תאים דו-ממדית – הוספת התרכובות (יום 2)עקוב אחר התאים על ידי מיקרוסקופ אור בלוחות עד שהתאים מגיעים למפגש של 70%-80%. שאפו את המדיום מהבארות בעזרת משאבת ואקום בארון סטרילי. מוסיפים 100 μL של מדיום DMEM טרי שחומם מראש ומניחים את הצלחות באינקובטור תרביות תאים. הכינו דילולים סדרתיים של תרכובות הבדיקה ובקרה חיובית בלוחות שקופים אוטוקלאביים מפוליפרופילן. בצע את הפתרונות הבאים עבור מדידות בודדות של נקודות זמן:הערה: התחל עם המניות ב- DMSO ודלל עם DMEM, אך אל תעלה על 1% v/v של DMSO בריכוז הסופי הגבוה ביותר.כדי לקבל תמיסה של 128 מיקרומטר של גרמיצדין S, הוסף 1.3 μL של תמיסת מלאי של 20 mM ל- 198.7 μL של DMEM. כדי לקבל פתרון של 256 מיקרומטר של LMB002, טופס “פתוח טבעת”, הוסף 1.3 μL של תמיסת 40 mM ל- 198.7 μL של DMEM. כדי לקבל פתרון של 512 מיקרומטר של LMB002, טופס “סגור טבעת”, הוסף 2.6 μL של תמיסת מלאי של 40 mM ל- 197.4 μL של DMEM. בצעו שלוש חזרות נוספות לקבלת ארבע קבוצות מכל נקודת ריכוז. מכינים סדרת דילול כפול על ידי שאיפת 100 μL מכל באר התחלה, העברה לבאר עם 100 μL DMEM, וערבוב יסודי.הערה: עבודה עם תרכובות הניתנות למיתוג דורשת התאמת תאורה כדי למנוע פוטואיזומריזציה לאחור. מומלץ לכבות את האור בארונות סטריליים. השג את הריכוזים הסופיים של התרכובות בבארות (5-150 מיקרומטר) על ידי העברת 100 מיקרוליטר של התמיסות המוכנות בכל פעם ב -56 בארות עם 100 מיקרוליטר של DMEM שנוסף בעבר. הוסף 100 μL של DMEM בכל פעם בארבע בארות כדי לשמש כבקרה שלילית. כסו את הצלחות ברדיד אלומיניום או בכיסוי פלסטיק מגן לא שקוף כדי למנוע פוטו-מיתוג בלתי מבוקר. הניחו את הצלחות באינקובטור תרביות תאים בטמפרטורה של 37°C (תוך שימוש מתחת למכסי לוחות פלסטיק נוספים) למשך זמן הדגירה שנבחר (10 דקות, 60 דקות, 24 שעות או 72 שעות). ניסוי תרבית תאים דו-ממדי – צביעה והדמיה (ימים 2-5)לאחר הדגירה עם תרכובות לתקופות שונות, מוסיפים 50 מיקרוליטר של תמיסת הצביעה לכל באר ללוחות שהיו מודגרים עם תרכובות במשך 10 ו -60 דקות. לדגור את הצלחות ב 37 ° C במשך 20 דקות.הערה: הכן פתרונות צביעת מלאי לכל נקודת זמן על-ידי הוספת 8 μL של תמיסת Hoechst 33342 של 20 mM (הריכוז הסופי הוא 5 μM), 32.5 μL של תמיסת 1 mM propidium iodide (PI) (הריכוז הסופי הוא 1 μM), ו-650 μL של FBS לא סטרילי ל-5,810 μL של PBS 1x לא סטרילי. חממו מראש FBS ו- PBS באמבט מים ב 37 °C כדי למנוע מהתאים לחוות הלם טמפרטורה. בצע הדמיה פלואורסצנטית אוטומטית באמצעות עדשת 20x אובייקטיבית. חזור על אותו הליך צביעה והדמיה (שלבים 1.4.1 -1.4.2) עבור הלוחות שהיו מודגרים עם תרכובות במשך 24 (יום 3) ו 72 (יום 5) שעות.הערה: מפות טיפוסיות של לוחות דו-ממדיים מוצגות באיור 2. ניסוי תרבית תאים תלת מימדית – זריעת התאים (יום 1)הערה: השלבים עבור חלק זה זהים לאלה המתוארים עבור הניסוי הדו-ממדי – הכנת תרבית התא, הדגירה עם התרכובות הנבדקות והדמיה (שלבים 1.1-1.4). עם זאת, במקרה זה, התאים מוכנים כספרואידים בוגרים קומפקטיים בלוח U-תחתון בעל הדבקה נמוכה במיוחד של 384 בארות עם קירות שחורים ולא שקופים. שימוש בצלחת בגודל כזה מאפשר להשוות בין שתי תרכובות בניסוי אחד.חזור על שלבים 1.2.1-1.2.9 מפרוטוקול הניסוי הדו-ממדי עם תרבית תאים LLC. לאחר ספירת התאים, להכין 25 מ”ל של השעיית התא. זרעו 1,000 תאים לבאר בכל הבארות ב-50 מיקרוליטר DMEM בצלחת U-bottom בעלת 384 בארות, קשירה נמוכה. צנטריפוגה ב 40 × גרם במשך 30 שניות ולנער עם שייקר צלחת ב 250 סל”ד במשך 1 דקה כדי לנער את התאים מדפנות הבארות לתחתית. הניחו את הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 על גבי מכסי לוחות פלסטיק נוספים כדי למנוע חימום לא אחיד של תחתית הצלחת למשך 48 שעות. ניסוי תרבית תאים תלת מימדית – הוספת התרכובות (יום 3)עקוב אחר התאים בצלחות באמצעות מיקרוסקופיה כדי להבטיח שנוצרו ספרואידים בוגרים קומפקטיים. הכן דילול סדרתי של תרכובות שנלמדו פוליפרופילן autoclaved לוחות ברורים. במקרה זה, כלול מתחם נוסף. בצע את הפתרונות הבאים עבור מדידות בודדות של נקודות זמן:כדי להשיג תמיסות של 175 μM ו- 350 μM של gramicidin S, הוסף 1.8 μL של תמיסת מלאי של 20 mM ל- 198.2 μL של DMEM והוסף 3.6 μL של מלאי ל- 196.4 μL של DMEM בהתאמה. כדי להשיג פתרונות של 175 μM ו- 350 μM של LMB002, טופס “פתוח טבעת”, הוסף 1 μL של תמיסת מלאי של 40 mM ל- 199 μL של DMEM והוסף 1.8 μL של מלאי ל- 198.2 μL של DMEM בהתאמה. כדי להשיג 350 μΜ ו- 1,750 μM solutions של LMB002, טופס “סגור טבעת”, הוסף 1.8 μL של תמיסת מלאי 40 mM ל- 198.2 μL של DMEM והוסף 8.8 μL של מלאי ל- 191.2 μL של DMEM בהתאמה. בצעו שלושה עותקים משוכפלים נוספים לקבלת ארבע קבוצות של כל נקודת ריכוז. לרכוש דילול סדרתי על ידי משיכת 20 μL מכל באר התחלה, להעביר אותו לבאר, עם 180 μL של DMEM, וערבוב יסודי.הערה: עבודה עם תרכובות הניתנות למיתוג דורשת התאמת תאורה כדי למנוע פוטואיזומריזציה לאחור. מומלץ לכבות את האורות בארונות סטריליים. להשיג את הריכוזים הסופיים של תרכובות בבארות על ידי העברת 20 μL של תמיסות מוכן בכל פעם ב 128 בארות המכילות 50 μL של DMEM. הוסף 20 μL של DMEM בכל פעם בשלוש בארות כדי לשמש בקרה. כסו את הצלחות ברדיד אלומיניום או בכיסוי מגן פלסטיק כדי למנוע פוטו-מיתוג או אידוי. הניחו את הצלחות באינקובטור תרבית תאים על מכסי צלחות פלסטיק למשך זמן הדגירה שנבחר. ניסוי תרבית תאים תלת מימדית – צביעה והדמיה (ימים 3-6)הכן את תמיסת הצביעה לנקודת זמן על ידי הוספת 13 μL של תמיסת 1 mM calcein AM (הריכוז הסופי הוא 1 μM), 22 μL של 20 mM Hoechst 33342 solution (הריכוז הסופי הוא 33 μM), 40 μL של 1 mM PI solution (הריכוז הסופי הוא 3 μM), 300 μL של FBS לא סטרילי ל 2,625 μL של 1x PBS לא סטרילי. חממו מראש FBS ו- PBS באמבט מים ב 37 °C כדי למנוע מהתאים לחוות הלם טמפרטורה. לאחר הדגירה לפרקי זמן שונים עם התרכובות, מוסיפים 20 מיקרוליטר של תמיסת הצביעה לבאר לבארות שהיו מודגרות בתרכובות במשך 10 דקות. לדגור ב 37 ° C במשך 2 שעות. בצע הדמיה קונפוקלית פלואורסצנטית באמצעות עדשה אובייקטיבית 20x. חזור על אותו הליך צביעה והדמיה עבור בארות שהיו מודגרות עם תרכובות במשך 24 (יום 4) ו 72 (יום 6) שעות.הערה: בניסוי זה, calcein AM משמש כמרכיב שלישי של תמיסת צביעה צבעונית. תמונות המתקבלות מניסויים דו-ממדיים ותלת-ממדיים מנותחות באמצעות תוכנת ניתוח התמונה האוטומטית של המכשיר. תאים המוכתמים יחד עם צבעי יודיד Hoechst ופרופידיום נחשבים למתים נמקיים, והשבר שלהם כפונקציה של הריכוז משמש לחישוב ערך IC50 . איור 2: דוגמה למפות לוחות טיפוסיות עבור ניסויי תרבית דו-ממדיים. קודי צבע עבור תרכובות ובקרה מסומנים. ריכוזי התרכובות שנבדקו (מספרים בתוך הבארות) ניתנים במיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. 2. קביעת יעילות הפוטו-מיתוג בפונדקאית רקמה הרכיבו את הרכבת האופטית עבור הקרנת הדגימה כפי שמוצג באיור 3 (המורכבת מכבל אופטי ממקור אור הלייזר, עדשה עם אורך מוקד משתנה, מזרק עם כיסוי לא שקוף וקצה חתך שטוח).על ידי שינוי אורך המוקד והצמצם של העדשה, קבל קרן אור שטוחה בקוטר הגדול ב 1-1.5 מ”מ מהקוטר הפנימי של המזרק המשומש אך עדיין, ככל האפשר, בתוך הצמצם. השתמשו במזרק 5 מ”ל עם קצה חתוך וקוטר פנימי של 12.4 מ”מ והוא מכוסה בכיסוי פלסטיק לא שקוף. בהספק לייזר של 200 mW, הגדר את צפיפות ההספק בפלט המערכת האופטית על ~ 103 mW / cm2 כפי שנמדד באמצעות פוטומטר.הערה: כל הפעולות הבאות חייבות להתבצע בחדר חשוך עם תאורה מינימלית אפשרית במקום העבודה. הכן 3 מ”ל של LMB002 (טופס “סגור טבעת”) תמיסת מלאי ב- PBS עם ריכוז של 1 מ”ג / מ”ל. הכינו דגימת רקמת מודל עמוסה בפוטופורם לא פעיל של LMB002 במיכל פלסטיק. בריצה טיפוסית, 5 גרם של בשר חזיר טחון טרי מעורבב מכנית עם 277 μL של LMB002 תמיסת מלאי ו 260 μL של PBS כדי להגיע לריכוז הסופי של 50 מ”ג / ק”ג בדגימה, ואת רקמת היחס / PBS של ~ 9/1 (v/v). ממלאים את המזרק בדגימה המוכנה, מוודאים שאין בועות אוויר בפנים, ויוצרים משטח שטוח בקצה החשיפה (החתוך).הערה: גליל הדגימה במזרק חייב לתפוס ~ 40 מ”מ לאורך הציר. הקרינו את הדגימה ברכבת האופטית כפי שמוצג באיור 3 למשך 9 דקות ו-44 שניות, בהתאמה לחשיפה של ~60 J/cm2 . הכינו פרוסות בעובי 4 מ”מ של הדגימה לאחר החשיפה על ידי דחיפתה מהמזרק באמצעות הבוכנה וחתכתה באזמל. שוקלים ומניחים את הפרוסות במבחנות נפרדות ומסמנים אותן לפי המרחק הממוצע (מ”מ) מהמשטח המוקרנ. הכינו שתי דגימות בקרה (כמות אופטימלית, 0.5-0.7 גרם) במבחנות: באחת, בשר טחון מעורבב עם 10% (נפח) של PBS (54 מיקרוליטר), ובשנייה, דגימת רקמת המודל המתקבלת בשלב 2.4 מוקרנת על ידי אור לייזר של 500 mW למשך 10 דקות כדי להבטיח שכל מולקולות LMB002 “סגורות טבעת” מומרים לצורה “פתוחה טבעתית”. הוסיפו תערובת אצטוניטריל-מים (70%/30% v/v, בתוספת 0.01% חומצה טריפלואורואצטית (TFA), 1.4 מ”ל/גרם) לכל פרוסה ולדגימות הביקורת. מערבבים היטב את התכולה באמצעות מוט זכוכית. דוגרים בטמפרטורת החדר לפחות 10 דקות וצנטריפוגות את התערובות ב 5220 x גרם במשך 20 דקות או צנטריפוגה ב 20 x גרם במשך 30 דקות פעמיים כדי להסיר את החומר הבלתי מסיס ולאסוף את supernatant. אספו בזהירות את הסופרנאטנטים (~0.7 מ”ל) וצנטריפוגו אותם שוב במהירות של 16,000 x גרם למשך 30 דקות. אסוף את הסופרנאטנטים (~0.5 מ”ל כל אחד) ונתח אותם באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה בעלת ביצועים גבוהים (RP HPLC) עם עמודת C18 אנליטית, שיפוע A:B ליניארי של 3.46% B/min, קצב זרימה של 2.0 מ”ל/דקה ו-100 μL של נפח מוזרק. רשום את הכרומטוגרמות שזוהו על-ידי UV ב-570 ננומטר (זיהוי של הטופס “סגור טבעת”) וב-270 ננומטר (זיהוי של הטופס “פתוח טבעת”). השתמש בדגימות הבקרה הלא מוקרנת (שלב 2.4) והבקרה המוקרנת (שלב 2.8) כדי לקבוע את זמני השמירה הספציפיים של שתי הצורות הפוטופורמיות (Eluent A: מימי 0.1% TFA; Eluent B: 90% אצטוניטריל-מים, 0,1% TFA) וכייל את השיטה. קבע את הכמויות בפועל של צורות פוטוגרפיות LMB002 בדגימות שנותחו באמצעות עקומות הכיול המתקבלות על ידי לקיחת וניתוח הכרומטוגרמות של תמיסות LMB002 בריכוזים ידועים. לכיול, הכינו פתרונות LMB002 “סגורים טבעתית” על ידי דילול תמיסת המלאי (שלב 2.3) בתערובת אצטוניטריל-מים (70%/30% v/v בתוספת 0.01% TFA) לקבלת 0.36, 0.9 ו-3.6 מיקרוגרם ל-100 מיקרוליטר (הנפח המוזרק); שיפוע ה- eluent וקצב הזרימה זהים לשלב 2.12. חזרו על הניסוי (שלבים 2.4-2.12) שלוש פעמים ושרטטו את האחוז המנורמל של כל פוטופורם על העלילה (אחוזים) לעומת המרחק (מפני השטח של הרקמה המוקרנת). חישוב הסטטיסטיקה (כלומר, סטיית תקן בכל נקודת ריכוז). איור 3: מערך ניסויי לקביעת יעילות המרת האור ברקמת מודל. (א) סכמטי ו-(ב) תצלום; 1, כבל אופטי ממקור אור הלייזר; 2, עדשה עם אורך מוקד משתנה; ו-3, תערובת מלח טחון בשר LMB002-פוספט-חוצץ מונחת ב-4, מזרק עם כיסוי לא שקוף וחזית חתוכה (מוצג ב-(B) ללא הכיסוי). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. 3. קביעת יעילות אנטי סרטנית In vivo הערה: לוח הזמנים ונקודות הסיום של הניסוי מוצגים באיור 4. תקני הטיפול בבעלי חיים בתקופה שלאחר הטיפול צריכים לעמוד בכללי 3R – דיור צריך לכלול צפיפות כלוב נאותה וזמינות משאבים. במידת האפשר, הקפידו על שיטות טיפול לא מרתיעות בבעלי חיים כגון מנהרה או כוסות רוח. איור 4: לוח זמנים לניסוי הטיפולי in vivo . ייעוד קבוצות הניסוי, פרטי הטיפול, נקודות קצה ולוחות זמנים לניתוח לאחר המוות . קיצורים: LLC = קרצינומה ריאות לואיס; IV = תוך ורידי; SC = תת עורית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. הכנת התאים הסרטניים לחיסון תת עורי (יום 0).מעבר תאי LLC ב- DMEM (4.5 גרם / ליטר גלוקוז) עם 10% FBS, 100 U/mL פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ”ל סטרפטומיצין ב 37 ° C ו 5% CO2. קצרו את התאים באמצעות תמיסת טריפסין-EDTA 0.05%, צנטריפוגה והשהו ב-DMEM ללא סרום. ספרו את התאים וקבעו את הכדאיות שלהם באמצעות בדיקת ההמוציטומטר והטריפאן הכחול. הכן תרחיף תאים סופי בריכוז 10 × 106 תאים / מ”ל בתערובת DMEM ומטריג’ל (1: 1). יש לשמור את המתלה על קרח לפני ההזרקה. חיסון תא LLC (יום 0)הניחו את עכבר C57BL/6NCrl הנקבה הבוגרת (במשקל ~20 גרם) בתא האינדוקציה של מכונת ההרדמה איזופלורן. בצע הרגעה ב 5% של isoflurane ולחכות עד בעל החיים הוא מחוסר הכרה לחלוטין. הסר את הפרווה מאזור חיסון התא על ידי גילוח. חסן 5 × 105 תאי LLC ב~ 100 μL של DMEM: תערובת מטריג’ל (1: 1) לתוך הגפה האחורית הימנית.הערה: במידת האפשר, הקפידו על תרגול השימוש במחט בודדת. ניהול תרכובת ופוטו-קרינההערה: תוך 5-8 ימים לאחר החיסון, בעלי החיים מוכנים לטיפול כאשר הגידולים שלהם מוחשיים והגיעו ~ 50-100 מ”מ3 נפח. בצע את כל הפעולות הבאות עם LMB002 ועכברים שטופלו על ידי מתחם זה בתנאים חשוכים למחצה (מנורת LED אחת של 4 W לפחות 5 מ ‘ממקום העבודה).יש להמיס LMB002 (צורה “סגורה טבעתית”) במי מלח פיזיולוגיים סטריליים בריכוז של 1 מ”ג/מ”ל במינון של 5 מ”ג/ק”ג (IV) לקבלת תמיסות הומוגניות בצבע כחול כהה. לפני ההקרנה, הרכיבו באופן אקראי ארבע קבוצות של שמונה בעלי חיים והסירו את הפרווה מהגידול ומאזורים סמוכים על ידי גילוח. הניחו עכבר במחזיק לזריקות IV וחממו מראש את זנב החיה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להפוך את וריד הזנב לגלוי.הערה: שקול שיכוך כאבים לפני הניתוח. יש להזריק את התרכובת במינון של 5 מ”ל/ק”ג לווריד הזנב. עבור שתי קבוצות הביקורת, יש להזריק 100 מיקרוליטר מלח (תוך ורידי) לכל חיה (20 גרם משקל גוף). ודא שבעלי החיים בשתי קבוצות הניסוי מקבלים את התרכובת הנבדקת בפוטופורם הלא פעיל (1 מ”ג/מ”ל במי מלח).הערה: במידת האפשר, הקפידו על תרגול השימוש במחט בודדת. לאחר מכן, 2 שעות 45 דקות לאחר הזרקת המתחם, מניחים את העכבר תחת הרדמה. השראת הרגעה עם איזופלורן 3%-4% בחמצן. יש לשמור על הרדמה למשך 15 דקות עם איזופלורן 0.5%-1% בחמצן. כסו את העכבר במסכה שחורה בעלת חור החושפת רק את אזור הגידול לאור. הפעל את מודול דיודת הלייזר עם לייזר 650 ננומטר והגדר את עוצמת הלייזר האדום ל- 200 mW ואת הלייזר המנחה הכחול / UV ל- 2 mW.הערה: השתמש במשקפי מגן כחולים כאשר התקן הלייזר מופעל. מדוד את שטף האור מהלייזר האדום (הרחק מהעכברים) באמצעות פוטומטר וקבע את המרחק מהכבל האופטי שבו שטף האור הוא 100 mW/cm2. קבע את הכבל על מעמד כדי לוודא שמקור האור נמצא במרחק שנקבע מהגידול והאור מכסה את כל אזור הגידול. השתמש באור לייזר מדריך כחול/UV במהלך הליך זה. הפעל את הלייזר האדום כדי להקרין את אזור הגידול למשך 20 דקות. לאחר הקרינה, לכבות את זרימת isoflurane, להחזיר את החיה לכלוב שלה, בזהירות לבחון את מצבו במשך 30 הדקות הבאות.הערה: לאחר מתן התרכובת, יש לשמור את העכברים בחושך למשך יומיים. יש לשנות רק את מחזור יום האור; כל שאר תנאי הדיור צריכים להישאר ללא שינוי. תצפיות לאחר הטיפולהתבוננו בבעלי החיים מדי יום ומדדו את משקל וממדי הגידולים שלהם. למדוד את נפח הגידול ולציין את התקדמות הנמק.הערה: תקני הטיפול בבעלי חיים בתקופה שלאחר הטיפול צריכים לעמוד בכללי 3R – דיור צריך לכלול צפיפות כלוב נאותה וזמינות משאבים. השתמש בנתונים שנאספו בשלב הקודם כדי להעריך תמותה. קבע את שיעור ההישרדות באמצעות ההליך הסטנדרטי.הערה: יש להקריב בעלי חיים ולספור אותם כמתים כאשר הם חושפים סימנים קליניים חמורים (ירידה במשקל הגוף של יותר מ -15%, כיב הגידול אינו נרפא תוך 7 ימים, וקול) או ברגע שנפח הגידול מגיע ל -2,500 מ”מ3.

Representative Results

בעבודה זו, ניסויים בתאים דו-ממדיים ותלת-ממדיים נערכו כדי לקבוע את IC50 עבור צורות “סגורות טבעת” ו”פתוחות טבעתית” של LMB002 (ראו איור 1) בזמני דגירה שונים. ערכים אלה הושוו לערכים שהתקבלו עבור אב הטיפוס של הפפטיד gramicidin S (המשמש כבקרה חיובית). קבוצה טיפוסית של תמונות של הדגירה בתרבית LLC שגדלה בדו-ממד לאחר צביעה מוצגת באיור 5. צביעה משותפת עם Hoechst 33342 (כחול) ופרופידיום יודיד (אדום) וכתוצאה מכך גוונים שונים של סגול בחלק גדול יותר של תאים במקרה של טיפול בצורה “פתוחה טבעתית” בהשוואה ל”טבעת סגורה” מצביעה על הבדל ניכר בציטוטוקסיות בין שתי צורות שניתן לכמת בקלות. הדוגמה המודגמת לניסוי מוצלח מבוססת על הנתונים שנאספו באמצעות תבנית צלחת של 96 בארות, שבה נוספו גרסאות הפפטיד בריכוזים משתנים, כפי שמוצג באיור 2. נתונים דומים ניתן לרכוש עם לוחות 384 באר צפיפות גבוהה. עם זאת, מאז נפחים לכל באר מופחתים, שגיאות טכניות ושיטתיות, וכתוצאה מכך, את הדיוק של קביעת IC50 יקטן עם הגדלת צפיפות הבאר. איור 5: תמונות מייצגות מבדיקת ציטוטוקסיות ב-LLC החד-שכבתי. התאים הוכתמו ב-Hoechst 33342 (כחול) וב-propidium iodide (אדום). הזמנים המוצגים: 10 דקות, 60 דקות, 24 שעות ו-72 שעות הם זמני דגירה עם תרכובות. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. הפוטו-המרה של LMB002 על ידי הקרנת אור לייזר ברקמת מודל – טחון חזיר טרי – נקבעה באמצעות דגימה המורכבת מבשר טחון מעורבב עם LMB002 “סגור טבעת” (לא פעיל) טופס מומס ב- PBS ומדידת ההמרה של צורה לא פעילה זו לצורה LMB002 “פתוחה טבעתית” (מופעלת) בכיוון התפשטות הקרינה. הדגימה הונחה במזרק והוקרנה מצד אחד עם קרן שטוחה של קרינת לייזר למשך זמן חשיפה של ~10 דקות (המשמש בדרך כלל בניסויי in vivo ), כפי שמוצג באיור 3. לאחר החשיפה, גליל הדגימה חולק לחלקים על ידי לחיצה על בוכנה מזרק חיתוך פרוסות באותו גובה עם אזמל. ריכוז LMB002 “פתוח-טבעת” בתמציות מהפרוסות נקבע באמצעות RP HPLC. איור 6 ממחיש את עקומות המינון-אפקט איור 6A-D המתקבל מניתוח נתונים. כדי לזהות את אחוז התאים המתים עם צביעה גרעינית משותפת של צבעי Hoechst 33342 ו-PI, השתמשנו בכלי מסווג מובנה שמגדיר ספים מספריים בפרמטרים נמדדים נבחרים כדי לפצל את כל ספירות התאים למספר קטגוריות. לדוגמה, כאשר אות התעלה האדומה (propidium iodide) בבקרה היה בסף (כ 110-130 יחידות), התאים יכולים להיות מסווגים PI-חיובי, נחשב מת, או PI-שלילי, נחשב כבלתי מושפע על ידי התרכובות. עבור LMB002, תלות סיגמואידית של אחוז תאים חיוביים יודיד פרופידיום על ריכוז התרכובת. מנתונים אלה ניתן לקבוע את ערכי IC50. איור 6: ניתוח ציטוטוקסיות בתרבית דו-ממדית. סיגמואיד מתאים כפי שהתקבלו בתרבית LLC עבור (A) 10 דקות, (B) 60 דקות, (C) 24 שעות, ו (D) 72 מרווחי זמן שעה שנלקחו עבור דגירה עם תרכובות. התאמה מאפשרת קביעה מדויקת של ערכי IC50 (לא מוצג). פסי שגיאה הם SEM. קיצורים: LLC = קרצינומת ריאות לואיס; PI = יודיד פרופידיום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. בהתחשב בערכי IC50 המתקבלים, אנו יכולים להסיק כי הרעילות של כל שלושת התרכובות גדלה עם זמן הדגירה. הניסוי שלנו גילה כי צורה “פתוחה טבעתית” של LMB002 היא בערך שלב דילול אחד פחות רעיל מאשר אב הטיפוס פפטיד גרמיצדין S. בעוד שהצורה “סגורה טבעתית” מדגימה שלושה עד ארבעה שלבי דילול רעילות נמוכה יותר, אשר עולה עם זמן הדגירה. ההבדל בין שני שלבי הדילול אינו מושפע מהעלייה בזמן הדגירה וניתן להשתמש בו מספרית כחלון פוטותרפי6 שנקבע בניסוי להשוואה עם תרכובות אחרות בהקרנה פוטנציאלית בספרייה. ערך IC50 עבור gramicidin S נקבע כנקודת ייחוס לתיקון טעויות ניסוי או תפוקות דיפרנציאליות בהעתקים ביולוגיים. ניסויי התאים התלת-ממדיים הפיקו את אותו סוג של נתונים גולמיים – תמונות ספרואיד חד-תאי שנפתרו על-ידי תא בודד. הכללת הקלצין כצבע צביעה שלישי מאפשרת לכמת את חלק התאים הפעילים מטבולית (שנצפה בתעלה הירוקה). על-ידי שימוש בלוחות של 384 בארות, הגדלת מספר העותקים המשוכפלים הטכניים, לא כולל נקודות זמן מיותרות של דגירה משותפת, ושינוי קפל הדילול, הצלחנו להשוות ישירות בין מספר תרכובות בריצת בדיקה אחת (באמצעות לוח יחיד) כפי שמודגם במפת הלוחות באיור 7. איור 7: מפת לוחות לניסוי תרבית תלת-ממדית עם שתי תרכובות. קודי צבע עבור תרכובות ובקרה מסומנים. המספרים בבארות הם ריכוזים במיקרומטר. 10 דקות, 24 שעות ו-72 שעות הם זמני הדגירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 8 מציג את התמונות של העתקים טכניים נבחרים של ספרואידים LLC שגדלו בצפיפות של 1 ספרואידים/באר בנוכחות תרכובות שנבדקו וספרואיד בקרה שנלכדו לאחר צביעה. איור 8: תמונות מייצגות מבדיקת ציטוטוקסיות של תרבית תלת-ממדית. תמונות מראות ספרואידים LLC בני 48 שעות מוכתמים ב- Hoechst 33342 (כחול), calcein AM (ירוק) ו- propidium iodide (אדום) לאחר 10 דקות, 24 שעות ו- 72 שעות דגירה משותפת עם צורות פוטופורמ LMB002 ו- gramicidin S. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. באמצעות תוכנת המכשיר, עקומות המינון-אפקט, כמו אלה שבניסוי הדו-ממדי, התקבלו מערימות התמונות שנערמו על ידי z (איור 9A). נוסף על כך, ספרואידים קומפקטיים ולא מעוותים בתרביות תלת-ממדיות יכולים להיות מאופיינים בקוטר של כדורית שלמה (איור 9B). כמו כן צוין כי קוטר הספרואיד הכולל משתנה עם ריכוז התרכובת. איור 9: הערכת ציטוטוקסיות עם תרביות תלת-ממדיות. (A) עקומות התאמה ציטוטוקסיות תלויות ריכוז ו-(B) חלקות קוטר של ספרואיד תלויות ריכוז שהתקבלו בתרביות התלת-ממדיות של LLC מודגרות יחד עם גרמיצדין S במשך 10 דקות, 24 שעות ו-72 שעות ונלכדו לפני הצביעה. קווי שגיאה הם SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. הניסוי בשלב 2 מאפשר לקבוע ריכוזי LMB002 בשתי הצורות הפוטוגרפיות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים המזוהים על ידי UV. היעילות של המרת אור ברקמות מודל הוערכה וכומתה בקלות באמצעות מערך זה (איור 3). הנתונים התקבלו מניתוח כמותי של הכרומטוגרמות של תמציות הדגימה. בניסויי בדיקה אלה, כרומטוגרמות LMB002 זוהו באופן ספקטרוסקופי ב-270 ננומטר וב-570 ננומטר. ב 270 ננומטר נצפו אותות רבים נוספים ויוחסו לתרכובות שחולצו יחד מרקמת המודל (אומתו מתמצית הבקרה ללא התרכובת). שתי הצורות הפוטוגרפיות היו שונות מספיק בזמני השמירה והספיגה. אולם האות LMB002 “פתוח טבעתית” הופרד מקו הבסיס של אותות הרקע האלה (ראו כרומטוגרמה מייצגת באיור 10A). לכן, אות זה יכול להיות משולב ללא בעיות. ב-570 ננומטר, הכרומטוגרמות הכילו רק אות צורה “סגור טבעת” LMB002 (איור 10B). כאן, ביצענו קביעת ריכוז באמצעות RP HPLC. עם זאת, דיוק גבוה עוד יותר ומגבלות זיהוי נמוכות יותר ניתן להשיג באמצעות LC / MS כשיטה אנליטית. איור 10: כרומטוגרמות מייצגות של LMB002 שחולצו מרקמות מודל. (A) דגימה בקוטר 2 מ”מ מפני השטח המוקרנים, שנרשמה ב-270 ננומטר (צורת LMB002 “פתוחה טבעת” משולבת); (B) דגימה במרחק של 38 מ”מ מפני השטח המוקרנים, שנרשמה ב-570 ננומטר (השיא של LMB002 “סגור טבעתית” משולב). ערכי זמן שמירה (מסומנים) אישרו בנוסף את זהות המתחם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. הנתונים שהתקבלו לאחר שילוב האותות המתאימים של כל הדגימות שנאספו שימשו לבניית גרפי עומק הריכוז, כפי שניתן לראות באיור 11. על בסיס גרפים אלה, יעילות ההמרה בעומקים שונים של רקמת המודל הוערכה בקלות. הוא מאשר כי מקור האור האדום שלנו גורם לפוטו-המרה “סגורה טבעתית” LMB002 בעומק של עד 1 c, בפונדקאית הרקמה, בשר טחון (בערך 103 mW / cm2). איור 11: הערכת יעילות פוטו-המרה. ריכוז (A, מ”ג/ק”ג) של צורות LMB002 “סגורות טבעת” (נקודות כחולות לא מופעלות) ו”פתוחות טבעתית” (נקודות כתומות מופעלות) במרחקים שונים מפני השטח המוקרנים של רקמת המודל (L, mm). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. תוצאות ניסוי in vivo – שלב 3 של המתודולוגיה שלנו שבוצע על פי לוח הזמנים המוצג באיור 4 – יוצגו על ידי גרפים המראים את צמיחת הגידול כפונקציה של זמן (איור 12) ועקומות הישרדות קפלן-מאייר (איור 13). איור 12: דינמיקה של צמיחת גידולים בבעלי חיים. בעלי חיים שטופלו ב- LMB002 בהשוואה לבעלי החיים שטופלו ברכב (מודל allograft LLC תת עורי בעכברי C57BL/6NCrl, מינון מורכב 7 מ”ג / ק”ג, IV, 2 שעות 40 דקות דגירה, ואז קרינה ב 650 ננומטר, 100 mW / cm2, 20 דקות). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 13: עקומות תמותה של בעלי חיים. בעלי חיים שטופלו ב- LMB002 בהשוואה לבעלי החיים שטופלו ברכב (מודל allograft LLC תת עורי בעכברי C57BL/6NCrl, מינון מורכב 7 מ”ג / ק”ג, IV, 2 שעות 40 דקות דגירה, ואז קרינה ב 650 ננומטר, 100 mW / cm2, 20 דקות). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

תרכובות פוטו-מבוקרות הן חסרות תקדים בפיתוח תרופות; עם זאת, לא נקבעו שיטות להערכתם הפרה-קלינית והקלינית. הטיפול האנלוגי הקרוב ביותר, פוטודינמי (PDT), הוא שיטת הטיפול לשימוש קליני שאומצה על ידי מדינות רבות נגד סרטן ונמצא בפיתוח עבור אינדיקציות אחרות^19,20. בדומה לפוטופרמקולוגיה, PDT מבוסס גם הוא על שימוש באור כדי להפעיל את החומר הביו-אקטיבי (חמצן סינגלט). לכן, ניתן לאמץ כמה שיטות ניסיוניות המשמשות למחקרים פרה-קליניים וקליניים ב- PDT עבור פוטופרמקולוגיה. לדוגמה, מקורות אור, גישות העברת אור ומכשירים רפואיים מפותחים היטב ומאושרים עבור PDT; הם יכולים לשמש ישירות להערכה של תרופות photocontrolled . עם זאת, PDT ופוטופרמקולוגיה יש הבדלים רבים אחד מהשני⁴, אשר מצדיק את הצורך להקים שיטות ספציפיות עבור האחרון.

ראשית, החומר הלא פעיל ב-PDT (חמצן) נמצא תמיד ברקמות חיות בריכוזים לא רעילים. לעומת זאת, תרכובות פעילות ביולוגית לא מבוקרות אור יכולות להיות בעלות פעילות שיורית ורעילות לא רצויה. לכן, תרופות פוטופרמקולוגיה אידיאליות צריכות למזער את הפעילות הביולוגית בצורתן הניתנת וחייבות להיות פעילות מאוד בצורתן המופקת מאור, “החלון הפוטותרפי”²¹ חייב להיות גדול ככל האפשר. איתור הלהיט וביצוע אופטימיזציה של פגע לעופרת מחייבים זיהוי תרכובות מתאימות וסינון ספריות גדולות יחסית, כבר בשלבים מוקדמים של פיתוח תרופות. כאן, הצענו מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי אוטומטי בתפוקה גבוהה כדי לזהות תרכובות פוטו-מיתוג יעילות.

השיטה שנבחרה להערכת ציטוטוקסיות מאפשרת יישום קל של הדרישה הקריטית ביותר – שמירה על PSS או יציבות של הפוטואיזומר הרגיש לאור הנראה. הסיבה לכך היא שעם יישומה, החשיפה לאור ממוזערת. לפיכך, אם בוחרים שיטות חלופיות, יש להעדיף שיטות אוטומטיות. גישה זו אמינה ואינפורמטיבית. השימוש בתרביות תאים תלת ממדיות (ספרואידים) בשלב זה מספק הבנה הוליסטית של תגובת התא לטיפול במיקרו-סביבה מציאותית יותר דמוית רקמה. בנוסף, ניתן לקבל תובנות חשובות לגבי מנגנון הפעולה של התרכובות באמצעות מיקרוסקופיה כשיטה ישירה. המיקרוסקופ הפלואורסצנטי הקונפוקלי עם פרוטוקול צביעה תקין מאפשר הערכה חזותית של המורפולוגיה של התאים והספרואידים; ניתן לזהות גם פרטים חשובים על מוות התא ושינויים בתוך התאים.

שנית, יישום קל דורש בחירה זהירה של מינון האור. ב PDT, מנת יתר אור מזיק מאוד לרקמות²². טיפול פוטופרמקולוגי יכול להיות יתרון תחת הקרנת אור מוגזמת. הגבול העליון של החומר המופעל מוגדר על ידי המינון המנוהל של החומר הלא מופעל והפרמקוקינטיקה שלו. עם זאת, מינון קל הוא עדיין בעיה בפוטופרמקולוגיה. יש להקפיד על כך שצפיפות ההספק המקרינה וזמן החשיפה לא יפחתו מהנדרש לטיפול. באופן עקרוני, הדור של החומר המופעל ניתן לפקח in vivo. עם זאת, מסיבות ביו-אתיות, הצענו ניסוי עם רקמת מודל (בשר טחון טרי) מעורבב עם התרכובת הלא פעילה¹⁵. ניסוי זה הוא פשוט וניתן לשנות אותו כדי להשתמש במקורות אור שונים. ניתן להתאים אותו גם להערכה פוטופיזית של מינון האור ולמדידת השפעות תרמיות. גם כאן, על ידי שימוש ברקמות מודל, ניתן למזער את החשיפה לאור, בהשוואה, למשל, לקביעת יעילות פוטו-מיתוג מדויקת יותר בתנאי in vivo , חלופה שתמיד עשויה להיות מעניינת לשקול.

לבסוף, ניתן לבחור את התרכובות המדגימות תכונות מעולות במסכי רעילות במבחנה ומבצעות פוטו-מיתוג יעיל בעומק של לפחות 1-1.5 ס”מ ברקמת המודל למחקרים יקרים, מייגעים וממושכים in vivo . בפרוטוקול זה, השתמשנו באותו קו תאים (LLC) כמו בהערכת מבחנה כדי ליצור את מודל הסרטן allograft. דינמיקת צמיחת הגידול, התמותה וספירת הגרורות הם הפרמטרים המתאימים ביותר להערכת יעילות אנטי-סרטנית. בהשוואה לכימותרפיה קונבנציונלית, גורם נוסף מוחל בטיפול הפוטופרמקולוגי – האור. לכן, יש צורך בשתי קבוצות של חיות ביקורת: אחת שמקבלת רק את הרכב והשנייה שמקבלת את הרכב והקרנה. מערך זה מאפשר להעריך את השפעת האור על הפרמטרים הנמדדים. בניסוי שלנו, בעלי החיים של שתי קבוצות הניסוי קיבלו את התרכובת הלא מופעלת, והגידולים של העכברים בקבוצה אחת הוקרנו. משטר ההקרנה היה זהה לקבוצות הביקורת והטיפול. השוואה עם כימותרפיה בנצ’מרק אינה הכרחית בשלב זה מכיוון שהמטרה העיקרית של הניסוי היא להדגים את ההשפעה המשולבת של יישום אור ותרכובת. לאחר מכן ניתן לבחור את התרכובות בעלות הביצועים הטובים ביותר המציגות השפעה זו למחקר נוסף על רעילותן in vivo ולהשוואה עם אמות מידה לקבלת החלטות חשובות לגבי התפתחותן. מבחינה טכנית, ניסוי in vivo שאנו מתארים יכול להיות מותאם בקלות למחקרים פרמקוקינטיים או פרמקודינמיים, למשל, של תרכובת שכבר נבחרה כמובילה התרופה.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים במימון האיחוד האירופי על ידי תוכנית H2020-MSCA-RISE באמצעות פרויקטים של PELICO (#690973) ו- ALISE (#101007256). עבודה זו נתמכה על ידי DFG-GRK 2039 (SA, TS ו- ASU), תוכנית NACIP של אגודת הלמהולץ (SA ו- ASU), וה- VIP+ של BMBF (OB ו- ASU). אנו מודים לד”ר סרהי קוניב, המכון הטכנולוגי של קרלסרוהה, שסינתז תרכובת LMB002, טיהר אותה וסיפק באדיבות את התרכובת למחקר. המחברים מודים גם לצ’ופרינה מקסים שצילמה והרכיבה את הסרטון באוקראינה, ולכל המגינים האמיצים של אוקראינה שאפשרו את העבודה הניסיונית, הכתיבה והצילום של פרסום זה.

Materials

Agilent 1100 Series capillary LC system	ALSI-Chrom (Agilent distributor)	–
ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Lewis lung carcinoma cell line	ECACC	90020104
C57BL/6NCrl mice, female, inbred	Charles River	Strain code: 027
CelCulture, CO₂ incubator	Esco Micro	CCL-170B
Corning Matrigel Basement membrane matrix	Merck	CLS354234
Corning, 384- well spheroid microplates	Merck	CLS3830
Fetal bovine serum	Merck	F7524
Gibco, DPBS	Thermo Fisher Scientific	21600044
Gramicidin S	Lumobiotics		Custom synthesis
HyClone, DMEM/high glucose	Cytiva	SH30003.04
IN Cell Analyzer 6500HS, imaging system	Cytiva	29240358
Invitrogen, Calcein AM	Thermo Fisher Scientific	C1430
Isoflurane anesthesia machine	ASA	S/N ASA 1305
L-glutamine, 200 mM solution	Merck	G7513
LIKA-surgeon, diode surgery laser	Fotonika plus	–
LMB002	Lumobiotics		Custom synthesis
Penicillin–Streptomycin, solution stabilized	Merck	P4333
PhenoPlate, 96-well plates	PerkinElmer	6055302
Photometer PCE-LED 20	PCE Instruments	PCE-LED 20
Thermo Scientific, Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	62249
Thermo Scientific, Propidium iodide	Thermo Fisher Scientific	J66764-MC
Trypan blue, 0.4% solution	Merck	T8154
Trypsin–EDTA, 10 x solution	Merck	T4174
UltraCruz Cell culture flasks with vented caps, 75 cm²	Santa Cruz Biotechnology	sc-200263
UltraCruz, bottle top filters, PES, 0.22 μm	Santa Cruz Biotechnology	sc-360882
Vydac 218TP, C18 HPLC column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm)	Altmann Analytik (Avantor distributor)	GR5103827

References

Fuchter, M. J. On the promise of photopharmacology using photoswitches: a medicinal chemist’s perspective. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (20), 11436-11447 (2020).
Volarić, J., Szymanski, W., Simeth, N. A., Feringa, B. L. Molecular photoswitches in aqueous environments. Chemical Society Reviews. 50, 12377-12449 (2021).
Paoletti, P., Ellis-Davies, G. C. R., Mourot, A. Optical control of neuronal ion channels and receptors. Nature Reviews Neuroscience. 20, 514-532 (2019).
Hüll, K., Morstein, J., Trauner, D. In Vivo Photopharmacology. Chemical Reviews. 118 (21), 10710-10747 (2018).
Ma, X., et al. In vivo photopharmacology with a caged mu opioid receptor agonist drives rapid changes in behavior. Nature Methods. 20, 682-685 (2023).
Sarabando, S. N., Palmeira, A., Sousa, M. E., Faustino, M. A. F., Monteiro, C. J. P. Photomodulation Approaches to Overcome Antimicrobial Resistance. Pharmaceuticals. 16 (5), 682 (2023).
Kolarski, D., Szymanski, W., Feringa, B. L., Hirota, T., Hatori, M., Panda, S. Chronophotopharmacology: Methodology for high spatiotemporal control over the circadian rhythm with light. Neuromethods. 186, (2022).
Babii, O., et al. Peptide drugs for photopharmacology: how much of a safety advantage can be gained by photocontrol. Future Drug Discovery. 2 (1), FDD28 (2020).
Davis, A. M., Keeling, D. J., Steele, J., Tomkinson, N. P., Tinker, A. C. Components of successful lead generation. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (4), 421-439 (2005).
Balani, S. K., Miwa, G. T., Gan, L., Wu, J., Lee, F. W. Strategy of utilizing in vitro and in vivo adme tools for lead optimization and drug candidate selection. Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (11), 1033-1038 (2005).
Kleijn, A., et al. A Systematic comparison identifies an ATP-based viability assay as most suitable read-out for drug screening in glioma stem-like cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
Rodrigues, J., Heinrich, M. A., Teixeira, L. M., Prakash, J. 3D in vitro model revolution: unveiling tumor-stroma interactions. Trends in Cancer. 7 (3), 249-264 (2021).
Sittinger, M., et al. Tissue engineering and autologous transplant formation: practical approaches with resorbable biomaterials and new cell culture techniques. Biomaterials. 17 (3), 237-242 (1996).
Matai, I., Kaur, G., Seyedsalehi, A., McClinton, A., Laurencin, C. T. Progress in 3D bioprinting technology for tissue/organ regenerative engineering. Biomaterials. 226, 119536 (2020).
Babii, O., et al. Direct photocontrol of peptidomimetics: an alternative to oxygen-dependent photodynamic cancer therapy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5493-5496 (2016).
De Ridder, K., et al. Novel 3D lung tumor spheroids for oncoimmunological assays. Advanced NanoBiomed Research. 2 (4), 2100124 (2022).
Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
Van Straten, D., Mashayekhi, V., De Bruijn, H. S., Oliveira, S., Robinson, D. J. Oncologic photodynamic therapy: basic principles, current clinical status and future directions. Cancers. 9 (2), 19 (2017).
Li, X., Kwon, N., Guo, T., Liu, Z., Yoon, J. Innovative strategies for hypoxic-tumor photodynamic therapy. Angewandte Chemie International Edition. 57 (36), 11522-11531 (2018).
Hull, K., Morstein, J., Trauner, D. In vivo photopharmacology. Chemical Reviews. 118 (21), 10710-10747 (2018).
Babii, O., et al. Structure-activity relationships of photoswitchable diarylethene-based β-hairpin peptides as membranolytic antimicrobial and anticancer agents. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (23), 10793-10813 (2018).
Heckl, C., Aumiller, M., Rühm, A., Sroka, R., Stepp, H. Fluorescence and treatment light monitoring for interstitial photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 388-396 (2020).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Horbatok, K., Makhnii, T., Kosach, V., Danko, V., Kovalenko, A., Fatiushchenkov, S., Borysko, P., Pishel, I., Babii, O., Ulrich, A. S., Schober, T., Afonin, S., Komarov, I. V. In Vitro and In Vivo Evaluation of Photocontrolled Biologically Active Compounds – Potential Drug Candidates for Cancer Photopharmacology. J. Vis. Exp. (199), e64902, doi:10.3791/64902 (2023).

Automatically Generated