Dit protocol presenteert een reeks experimenten die zijn aangenomen voor de evaluatie van fotoschakelbare antikankerpeptiden, die kunnen worden gebruikt bij de preklinische screening van dergelijke verbindingen. Dit omvat cytotoxiciteitsbeoordeling in 2D- en 3D-celculturen, de evaluatie van ex vivo (modelweefsel) foto-isomerisatie-efficiëntie en in vivo werkzaamheid.
Fotogecontroleerde, biologisch actieve verbindingen zijn een opkomende klasse van “slimme” kandidaat-geneesmiddelen. Ze bieden extra veiligheid bij systemische chemotherapie vanwege hun nauwkeurige spatiotemporale activering door een goedaardig, niet-ioniseerbaar licht naar een specifieke locatie in het lichaam van de patiënt te leiden. Dit artikel presenteert een reeks methoden om de in vitro potentie en ex vivo efficiëntie van de fotoactivatie van fotogecontroleerde, biologisch actieve verbindingen te evalueren, evenals de in vivo werkzaamheid in vroege stadia van de ontwikkeling van geneesmiddelen. De methodologie wordt toegepast op cytotoxische peptiden tegen kanker, namelijk de diaryletheen-bevattende analogen van een bekend antibioticum, gramicidin S. De experimenten worden uitgevoerd met behulp van 2D (adherente cellen) en 3D (sferoïden) celculturen van een kankercellijn (Lewis longcarcinoom, LLC), levend weefsel surrogaten (varkensvleesgehakt) en een allograft kankermodel (subcutane LLC) in immunocompetente muizen. De selectie van de meest effectieve verbindingen en schatting van realistische fototherapeutische vensters worden uitgevoerd via geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie. De fotoactiveringsefficiëntie bij verschillende verlichtingsregimes wordt bepaald op verschillende diepten in een modelweefsel en de optimale lichtdosering wordt toegepast in het uiteindelijke therapeutische in vivo experiment.
Fotogecontroleerde biologisch actieve verbindingen zijn de afgelopen decennia naar voren gekomen als een veelbelovend onderdeel van veilige chemotherapieën voor menselijke ziekten en om specifiek kwaadaardige vaste tumoren uit te roeien1. Deze verbindingen bevatten reversibele foto-isomiseerbare fragmenten (moleculaire fotoschakelaars) en kunnen schakelen tussen inactieve en actieve foto-isomeren bij bestraling met licht van verschillende golflengten.
In vergelijking met hun niet-fotocontroleerbare analogen kunnen fotogecontroleerde geneesmiddelen veiliger zijn omdat ze systemisch in het lichaam van de patiënt kunnen worden ingebracht in minder actieve en in wezen niet-toxische vormen, en vervolgens alleen door licht worden geactiveerd waar nodig, zoals in tumoren, zweren en wonden. Hoewel meerdere opwindende demonstraties van dergelijke prototypes van moleculaire geneesmiddelen te vinden zijn in recente academische artikelen 2,3,4,5,6,7, bestaat het gebied van klinische fotofarmacologie – een toepassing van goedgekeurde combinaties van geneesmiddelen / medische hulpmiddelen / ziekten – niet. Fotofarmacologie bevindt zich nog in de fase van geneesmiddelenontdekking en systematische preklinische studies zijn onbekend.
We hebben pas zeer recent het in vivo veiligheidsvoordeel aangetoond voor sommige fotogecontroleerde antikankerpeptiden, namelijk de analogen van het peptide-antibioticum gramicidin S8. Deze fotogecontroleerde derivaten bevatten een diaryledatheen (DAE) fotoschakelaar, die omkeerbare foto-geïnduceerde transformaties ondergaat tussen de zogenaamde roodlicht-gegenereerde “ring-open” en UV-gegenereerde “ring-gesloten” fotovormen (geïllustreerd in figuur 1 voor een van de derivaten, verbinding LMB002).
Figuur 1: Fotogecontroleerd cytotoxisch peptide LMB002 en zijn foto-isomerisatie. Het dagboekledheenfragment is in rood weergegeven. Afkorting: DAE = diarylethene. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het vinden van hits en het uitvoeren van hit-to-lead optimalisatie vereisen vaak in vitro en in vivo screening van geschikte samengestelde bibliotheken 9,10. Hier demonstreren we een methodologie die geschikt is voor de systematische high-throughput screening van cytotoxiciteit van fotogecontroleerde verbindingen. We bepalen ook de foto-isomerisatie-efficiëntie, schatten de lichtdosis in modelweefsels en evalueren de in vivo werkzaamheid van de best presterende kandidaten. De aanpak is in overeenstemming met bio-ethiek en dierverzorgingsoverwegingen.
In dit werk worden traditionele preklinische methoden aangepast om de niet-gecontroleerde foto-isomerisatie van geteste verbindingen te voorkomen. Het algemene doel van het toepassen van deze gemodificeerde methoden hierin is het ontwikkelen van een algemene strategie die eenvoudig en snel is en statistisch significante gegevens oplevert om in vitro activiteiten betrouwbaar te vergelijken en de in vivo werkzaamheidstests van fotoschakelbare verbindingen voor loodidentificatie en verdere ontwikkeling te rationaliseren.
De strategie bestaat uit drie opeenvolgende stappen. De eerste stap omvat de bepaling van IC50 (schijnbare 50 % cel levensvatbaarheid) in seriële verdunningen voor de actieve en inactieve fotovormen van geselecteerde fotogecontroleerde biologisch actieve verbindingen met behulp van tweedimensionale (2D, monolayer) en driedimensionale (3D, sferoïde) celculturen en confocale high-throughput geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie. Fototherapeutische vensters worden vergeleken met betrekking tot het IC50-verschil tussen de twee fotovormen en de best presterende kandidaten worden geselecteerd. Er is geen specifiek voordeel bij toxiciteitsbeoordeling door geautomatiseerde microscopie en andere cytotoxiciteitsscreeningplatforms (assays)11; Complexere celgebaseerde tumormodellen12 kunnen in dit stadium eenvoudig worden geïmplementeerd.
Voor de verbindingen die in stap 1 zijn geselecteerd, is de tweede stap het realistisch schatten van hun fotoschakelingsefficiëntie in de weefsels als functie van de diepte van het bestraalde weefseloppervlak door de fotoschakelingsefficiëntie van de minder actieve fotovormen in een weefselsurrogaat te kwantificeren met behulp van UV-gedetecteerde high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) van bestraalde monsterextracten. In vivo kan de efficiëntie van fotoswitching worden bestudeerd, maar we stellen voor om een eenvoudig weefselsurrogaat te gebruiken – gehakt varkensvlees. We hebben de validiteit van deze aanpak getest. We maten de conversie van onze fotoschakelbare verbindingen in vivo op een muizenkankermodel en observeerden ongeveer dezelfde fotoconversie op een diepte gemeten in eerdere experimenten met muizen8. Elk geschikt alternatief kunstmatig weefsel13, 3D-biogeprint weefsel/ orgaan 14, biopsiemateriaal of ander vrijgesteld dierlijk materiaal kan worden gebruikt. Deze opstelling is echter een goed compromis omdat het economisch, snel en ethisch is.
De derde stap is de bepaling van in vivo antikanker werkzaamheid in een muizenkankermodel. De verbindingen die superieure eigenschappen vertonen in de in vitro experimenten en efficiënt fotoswitchen op een diepte van ten minste 1-1,5 cm in de modelweefsels worden geselecteerd voor dit experiment.
Dit protocol kan worden toegepast op verbindingen met verschillende soorten fotoschakelaars, op voorwaarde dat hun fotovormen (of hun fotostationaire toestanden, PSS) stabiel zijn gedurende een redelijke tijd (een paar dagen of langer). Ter illustratie wordt een eerder beschreven DAE-afgeleide LMB002 gebruikt15. De LMB002 fotovormen zijn thermisch stabiel en kunnen minstens een jaar bij −20 °C bewaard worden zonder noemenswaardige degradatie. Lewis longcarcinoom (LLC) cellen worden gekozen voor deze in vitro en in vivo demonstratie, maar er worden geen beperkingen opgelegd aan het celtype. LLC-cellen zijn aanhangend, gemakkelijk te kweken in 3D en worden gebruikt om tumoroïden te genereren (zoals beschreven in de referentie16). In vivo LLC-cellen worden gebruikt om metastatische processen te modelleren en kunnen gemakkelijk solide tumoren genereren bij immunocompetente muizen na subcutane injectie. Deze in vivo methodologie kan universeel worden toegepast op andere kankermodellen17,18. De gedetailleerde implementatie van deze strategie wordt hieronder beschreven.
Fotogecontroleerde verbindingen zijn ongekend in de ontwikkeling van geneesmiddelen; Er zijn echter geen methoden vastgesteld voor hun preklinische en klinische evaluatie. De dichtstbijzijnde monotherapie-analoog, fotodynamische therapie (PDT), is de behandelingsmodaliteit voor klinisch gebruik die door veel landen tegen kanker wordt gebruikt en is in ontwikkeling voor andere indicaties19,20. Net als fotofarmacologie is PDT ook gebaseerd op het gebruik van licht om de bioactieve stof (singlet zuurstof) te activeren. Daarom kunnen sommige experimentele methoden die worden gebruikt voor preklinische en klinische studies in PDT worden gebruikt voor fotofarmacologie. Lichtbronnen, lichtafgiftebenaderingen en medische hulpmiddelen zijn bijvoorbeeld goed ontwikkeld en goedgekeurd voor PDT; Ze kunnen direct worden gebruikt voor de evaluatie van fotogecontroleerde geneesmiddelen. PDT en fotofarmacologie hebben echter veel verschillen van elkaar4, wat de noodzaak rechtvaardigt om specifieke methoden voor de laatste vast te stellen.
Ten eerste is de niet-geactiveerde stof in PDT (zuurstof) altijd aanwezig in levende weefsels in niet-toxische concentraties. Daarentegen kunnen niet-geactiveerde fotogecontroleerde biologisch actieve verbindingen restactiviteit en ongewenste toxiciteit hebben. Daarom moeten ideale fotofarmacologische geneesmiddelen de biologische activiteit in hun toegediende vorm hebben geminimaliseerd en zeer actief zijn in hun door licht gegenereerde vorm, het “fototherapeutische venster”21 moet zo groot mogelijk zijn. Het vinden van de hit en het uitvoeren van hit-to-lead optimalisatie vereist de identificatie van geschikte verbindingen en de screening van relatief grote bibliotheken, al in een vroeg stadium van de ontwikkeling van geneesmiddelen. Hier stelden we een geautomatiseerde confocale fluorescerende microscopie met hoge doorvoer voor om efficiënte fotoschakelverbindingen te identificeren.
De gekozen methode voor cytotoxiciteitsevaluatie maakt een eenvoudige implementatie van de meest kritische vereiste mogelijk – behoud van de PSS of stabiliteit van het zichtbaar-lichtgevoelige foto-isomeer. Dit komt omdat, bij de implementatie, de blootstelling aan licht wordt geminimaliseerd. Daarom moet bij het selecteren van alternatieve methoden de voorkeur worden gegeven aan geautomatiseerde methoden. Deze aanpak is betrouwbaar en informatief. Het gebruik van 3D-celculturen (sferoïden) in dit stadium biedt een holistisch begrip van de reactie van de cel op de behandeling in een meer realistische weefselachtige micro-omgeving. Bovendien kunnen waardevolle inzichten in het werkingsmechanisme van de verbindingen worden verkregen met behulp van microscopie als directe methode. De confocale fluorescerende microscopie met het juiste kleuringsprotocol maakt de visuele beoordeling van de morfologie van de cellen en sferoïden mogelijk; Belangrijke details over de celdood en veranderingen in de cellen kunnen ook worden gedetecteerd.
Ten tweede vereist lichte toepassing een zorgvuldige keuze van de lichtdosering. Bij PDT is een lichte overdosis uiterst schadelijk voor weefsels22. Fotofarmacologische therapie kan voordelig zijn bij overmatige lichtbestraling. De bovengrens van de geactiveerde stof wordt bepaald door de toegediende dosis van de niet-geactiveerde stof en de farmacokinetiek ervan. Lichtdosering is echter nog steeds een probleem in de fotofarmacologie. Er moet voor worden gezorgd dat het bestralingsvermogen en de blootstellingstijd niet minder zijn dan de vereiste voor de therapie. In principe kan de aanmaak van de geactiveerde stof in vivo worden gemonitord. Om bio-ethische redenen stelden we echter een experiment voor met een modelweefsel (vers gehakt) gemengd met de niet-geactiveerde verbinding15. Dit experiment is eenvoudig en kan worden aangepast om verschillende lichtbronnen te gebruiken. Het kan ook worden aangepast voor de fotofysische schatting van de lichtdosering en de meting van thermische invloeden. Ook hier is het mogelijk om door gebruik te maken van modelweefsels de lichtbelichting te minimaliseren, bijvoorbeeld vergeleken met de nauwkeurigere bepaling van de fotoschakelefficiëntie in de in vivo omstandigheden, een alternatief dat altijd interessant kan zijn om te overwegen.
Ten slotte kunnen de verbindingen die superieure eigenschappen vertonen in de in vitro toxiciteitsschermen en efficiënt fotoswitching van ten minste 1-1,5 cm diep in het modelweefsel worden geselecteerd voor kostbare, bewerkelijke en langdurige in vivo studies. In dit protocol gebruikten we dezelfde cellijn (LLC) als in de in vitro beoordeling om het allograft kankermodel te genereren. De tumorgroeidynamiek, mortaliteit en metastasetelling zijn de parameters die het meest geschikt zijn voor het beoordelen van de werkzaamheid tegen kanker. In vergelijking met conventionele chemotherapie wordt een extra factor toegepast in de fotofarmacologische behandeling – het licht. Daarom zijn twee groepen bestrijdingsdieren nodig: een die alleen het voertuig ontvangt en de andere die het voertuig en de bestraling ontvangt. Deze opstelling maakt de evaluatie van de impact van licht op de gemeten parameters mogelijk. In ons experiment ontvingen de dieren van de twee experimentele groepen de niet-geactiveerde verbinding en werden de tumoren van de muizen in één groep bestraald. Het bestralingsregime was identiek voor de controle- en behandelingsgroepen. Vergelijking met benchmarkchemotherapie is in dit stadium niet nodig omdat het belangrijkste doel van het experiment is om het gecombineerde effect van lichte en samengestelde toepassing aan te tonen. De best presterende verbindingen die dit effect vertonen, kunnen vervolgens worden geselecteerd voor verder onderzoek naar hun in vivo toxiciteit en vergelijking met benchmarks voor het nemen van belangrijke go-no-go-beslissingen over hun ontwikkeling. Technisch gezien kan het in vivo experiment dat we beschrijven gemakkelijk worden aangepast aan farmacokinetische of farmacodynamische studies, bijvoorbeeld van een verbinding die al is geselecteerd als het geneesmiddellood.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen EU-financiering door het H2020-MSCA-RISE-programma via PELICO (#690973) en ALISE (#101007256) projecten. Dit werk werd ondersteund door de DFG-GRK 2039 (SA, TS en ASU), het NACIP-programma van de Helmholtz Society (SA en ASU) en de VIP + van de BMBF (OB en ASU). We erkennen Dr. Serhii Koniev, Karlsruhe Institute of Technology, die de verbinding LMB002 heeft gesynthetiseerd, gezuiverd en vriendelijk de verbinding voor de studie heeft verstrekt. De auteurs zijn ook dankbaar voor Chupryna Maksym die de video in Oekraïne heeft gefilmd en samengesteld, en voor alle dappere verdedigers van Oekraïne die het experimentele werk, het schrijven en filmen van deze publicatie mogelijk hebben gemaakt.
Agilent 1100 Series capillary LC system | ALSI-Chrom (Agilent distributor) | – | |
ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Lewis lung carcinoma cell line | ECACC | 90020104 | |
C57BL/6NCrl mice, female, inbred | Charles River | Strain code: 027 | |
CelCulture, CO2 incubator | Esco Micro | CCL-170B | |
Corning Matrigel Basement membrane matrix | Merck | CLS354234 | |
Corning, 384- well spheroid microplates | Merck | CLS3830 | |
Fetal bovine serum | Merck | F7524 | |
Gibco, DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21600044 | |
Gramicidin S | Lumobiotics | Custom synthesis | |
HyClone, DMEM/high glucose | Cytiva | SH30003.04 | |
IN Cell Analyzer 6500HS, imaging system | Cytiva | 29240358 | |
Invitrogen, Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | |
Isoflurane anesthesia machine | ASA | S/N ASA 1305 | |
L-glutamine, 200 mM solution | Merck | G7513 | |
LIKA-surgeon, diode surgery laser | Fotonika plus | – | |
LMB002 | Lumobiotics | Custom synthesis | |
Penicillin–Streptomycin, solution stabilized | Merck | P4333 | |
PhenoPlate, 96-well plates | PerkinElmer | 6055302 | |
Photometer PCE-LED 20 | PCE Instruments | PCE-LED 20 | |
Thermo Scientific, Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
Thermo Scientific, Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | J66764-MC | |
Trypan blue, 0.4% solution | Merck | T8154 | |
Trypsin–EDTA, 10 x solution | Merck | T4174 | |
UltraCruz Cell culture flasks with vented caps, 75 cm2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-200263 | |
UltraCruz, bottle top filters, PES, 0.22 μm | Santa Cruz Biotechnology | sc-360882 | |
Vydac 218TP, C18 HPLC column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm) | Altmann Analytik (Avantor distributor) | GR5103827 |