Évaluation in vitro et in vivo de composés biologiquement actifs photocontrôlés - candidats médicaments potentiels pour la photopharmacologie du cancer

Les soins aux animaux et les procédures expérimentales ont été effectués conformément aux réglementations locales et internationales pour la conduite de projets de recherche impliquant des animaux de laboratoire (Loi de l’Ukraine sur la protection des animaux contre la cruauté, Convention européenne sur la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales ou à d’autres fins scientifiques (Convention européenne, Strasbourg, 1986), Directive 2010/63/UE sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques). Cette étude est approuvée par la Commission de Bioéthique de la société Bienta. Des souris C57BL/6NCrl (femelles adultes pesant environ 20 g chacune) ont été utilisées dans ces expériences. Les matériaux, réactifs et équipements spécifiques sont énumérés dans le tableau des matériaux. 1. Évaluation IC50 pour LMB002 (formes « fermées en anneau » et « ouvertes en anneau ») à l’aide de cultures cellulaires LLC 2D et 3D Préparation des tampons et des solutions mères des composésREMARQUE : Préparez les tampons à l’aide des procédures standard. Vous pouvez également utiliser des solutions disponibles dans le commerce.Préparer 10x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en ajoutant 14,2 g deNa2HPO4, 2,4 g de KH2PO4, 80 g de NaCl et 2 g de KCl à 1 L d’eau distillée. Autoclave préparé 10x PBS et le diluer dans une solution 1x en ajoutant 100 ml de solution 10x à 900 mL d’eau distillée. Ensuite, conservez la solution à 4 °C. Préparer le PBS (DPBS) de Dulbecco en ajoutant 4,78 g de poudre de DPBS à 1 L d’eau distillée. Remuer la solution jusqu’à ce que tout le solide se dissolve, vérifier le pH à l’aide d’un pH-mètre et l’ajuster en ajoutant 1 M NaOH ou 1 M HCl (pH 7,3-7,4). Après avoir atteint le niveau de pH souhaitable, filtrer le milieu à travers un filtre à vide de 0,22 μm dans une armoire stérile. Conserver à 4 °C. Préparer 1 M de solution tampon d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinééthanésulfonique (HEPES) en ajoutant 238,3 g de HEPES à 1 L d’eau distillée. Ajuster le pH de la solution avec 1 M de NaOH jusqu’à pH 7,5. Filtrer à travers un filtre à vide de 0,22 μm dans une armoire stérile. Conserver à 4 °C. Préparer 1x solution de trypsine-EDTA (EDTA = acide éthylènediaminetétraacétique) en diluant 10x solution. Pour ce faire, ajoutez 5 mL de 10x Trypsin-EDTA à 45 mL 1x PBS solution dans un tube stérile de 50 mL. Conserver à 4 °C. Préparer le milieu Eagle modifié (DMEM) de base de Dulbecco en ajoutant 13,4 g de poudre de DMEM à haute teneur en glucose et 3,7 g de Na2CO3 à 1 L d’eau distillée dans une éprouvette graduée à l’aide d’une tige d’agitation magnétique placée sur une plaque d’agitation. Remuer la solution jusqu’à ce que tout le solide se dissolve, vérifier le pH à l’aide d’un pH-mètre et l’ajuster en ajoutant 1 M NaOH ou 1 M HCl (pH 7,3-7,4). Après avoir atteint le pH souhaitable, filtrer le milieu à travers un filtre à vide de 0,22 μm dans une armoire stérile et conserver à 4 °C. Préparer le milieu complet DMEM en ajoutant 100 mL de sérum fœtal bovin (FBS), 10 mL de solution pénicilline-streptomycine, 10 mL de solution de L-glutamine et 10 mL de tampon HEPES 1 M à 900 mL de DMEM basique. Conserver à 4 °C. Préparer les solutions mères pour les composés d’essai.Pour chaque composé, peser deux lots de 5,12 mg (p. ex. LMB002) dans la photoforme fermée à anneau dans deux tubes microcentrifugés de 1,5 mL (un avec des parois transparentes et l’autre noir non transparent). Peser 2,28 mg de témoin positif (p. ex. gramicidine S) dans un tube mural extra-transparent. Ajouter 100 μL de DMSO pur à chaque échantillon et vortex pendant 30 s. Photoisomériser la solution mère (LMB002) dans le tube à paroi transparente de la forme « fermée à anneau » à la forme « anneau-ouverte » en irradiant la solution avec un laser 660 nm (densité de puissance lumineuse 0,6 W / cm2) avec vortex pour assurer un mélange complet. Continuez jusqu’à ce que la couleur passe visiblement du violet foncé au brun clair. Protéger de la lumière à l’aide de papier d’aluminium. Expérience de culture cellulaire 2D – ensemencement des cellules (jour 1)Transvaser 10 mL du milieu complet DMEM du ballon T-75 avec une culture cellulaire LLC vers un tube stérile de 15 mL. Aspirer le milieu restant avec une pompe à vide. Lavez la culture cellulaire avec 5 ml de 1x DPBS et aspirez la solution avec une pompe à vide. Couvrir les cellules avec 3 mL de 1x solution trypsine-EDTA et incuber la fiole pendant 2-3 min à 37 °C dans une atmosphère de 5% de CO2 . Arrêter l’action de la trypsine en ajoutant 6 mL du milieu DMEM (préalablement transféré dans un tube stérile) dans le flacon de culture cellulaire contenant 1x solution trypsine-EDTA et en pipetant la suspension plusieurs fois pour laver les cellules des parois du flacon de culture cellulaire. Transférer la suspension dans un tube de 15 ml et centrifuger à 200 × g pendant 4 min. Après centrifugation, aspirer le surnageant avec une pompe à vide. Évitez de toucher la pastille de la cellule au fond du tube. Remettez les cellules en suspension en ajoutant 2 mL de milieu complet DMEM frais et en pipetant plusieurs fois. Compter les cellules en échantillonnant environ 15 μL de la suspension dans un tube de 0,5 mL, en ajoutant 15 μL de bleu de trypan à 0,4% et en transférant le mélange obtenu dans une chambre de comptage des cellules. Après le comptage, préparer 25 mL de la suspension cellulaire par point temporel. Semer 5 000 à 10 000 (8 000 en moyenne) cellules LLC/puits dans 200 μL de DMEM dans les 60 puits centraux d’une plaque de 96 puits avec fond clair et parois noires non transparentes. Remplissez les 36 puits restants avec du DMEM pur. Placez les plaques dans un incubateur de culture cellulaire pendant une nuit à 37 °C et 5% de CO2. Utilisez des couvercles de plaques en plastique en dessous pour éviter le chauffage inégal de la plaque inférieure. Expérience de culture cellulaire 2D – ajout des composés (jour 2)Surveillez les cellules par microscopie optique dans les plaques jusqu’à ce que les cellules aient atteint 70% à 80% de confluence. Aspirez le fluide des puits avec une pompe à vide dans une armoire stérile. Ajouter 100 μL du milieu DMEM frais préchauffé et placer les plaques dans un incubateur de culture cellulaire. Préparer les dilutions en série des composés d’essai et le témoin positif dans des plaques transparentes autoclavées en polypropylène. Effectuez les solutions suivantes pour les mesures ponctuelles individuelles :NOTE: Commencez avec les stocks de DMSO et diluez avec du DMEM, mais ne dépassez pas 1% v/v de DMSO à la concentration finale la plus élevée.Pour obtenir une solution 128 μM de gramicidine S, ajouter 1,3 μL de solution mère de 20 mM à 198,7 μL de DMEM. Pour obtenir une solution 256 μM de LMB002, forme « à anneau ouvert », ajouter 1,3 μL de solution de 40 mM à 198,7 μL de DMEM. Pour obtenir une solution 512 μM de LMB002, forme « fermée par anneau », ajouter 2,6 μL de solution mère de 40 mM à 197,4 μL de DMEM. Effectuer trois répétitions supplémentaires pour obtenir quatre séries de chaque point de concentration. Préparer une série de double dilution en aspirant 100 μL de chaque puits de départ, en transférant dans un puits avec 100 μL de DMEM et en mélangeant soigneusement.REMARQUE: Le travail avec des composés photocommutables nécessite un réglage de l’éclairage pour empêcher la photoisomérisation arrière. Il est recommandé d’éteindre la lumière dans les armoires stériles. Obtenir les concentrations finales des composés dans des puits (5-150 μM) en transférant 100 μL des solutions préparées à chaque fois dans 56 puits avec 100 μL de DMEM préalablement ajouté. Ajouter 100 μL de DMEM à chaque fois dans quatre puits pour servir de témoin négatif. Plaques de recouvrement avec papier d’aluminium ou couvercle de protection en plastique non transparent pour empêcher la photocommutation incontrôlée. Placez les plaques dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C (en utilisant des couvercles de plaques en plastique supplémentaires) pendant la durée d’incubation choisie (10 min, 60 min, 24 h ou 72 h). Expérience de culture cellulaire 2D – coloration et imagerie (jours 2-5)Après incubation avec des composés pour différentes périodes, ajouter 50 μL de la solution de coloration par puits aux plaques qui ont été incubées avec des composés pendant 10 et 60 min. Incuber les plaques à 37 °C pendant 20 min.REMARQUE : Préparer les solutions de coloration par point temporel en ajoutant 8 μL de solution Hoechst 33342 de 20 mM (concentration finale de 5 μM), 32,5 μL de solution d’iodure de propidium (PI) de 1 mM (concentration finale de 1 μM) et 650 μL de FBS non stérile à 5 810 μL de PBS non stérile 1x. Préchauffez FBS et PBS au bain-marie à 37 °C pour éviter que les cellules ne subissent un choc thermique. Effectuez une imagerie de fluorescence automatisée à l’aide d’une lentille d’objectif 20x. Répétez la même procédure de coloration et d’imagerie (étapes 1.4.1 -1.4.2) pour les plaques qui ont été incubées avec des composés pendant 24 (jour 3) et 72 (jour 5) h.REMARQUE : Les cartes de plaques 2D typiques sont illustrées à la figure 2. Expérience de culture cellulaire 3D – ensemencement des cellules (jour 1)REMARQUE : Les étapes de cette section sont identiques à celles décrites pour la préparation expérimentale 2D de la culture cellulaire, l’incubation avec les composés testés et l’imagerie (étapes 1.1-1.4.) Cependant, dans ce cas, les cellules sont préparées sous forme de sphéroïdes matures compacts dans une plaque de fond en U à ultra-faible adhérence de 384 puits avec des parois noires non transparentes. L’utilisation d’une plaque de cette taille permet de comparer deux composés en une seule expérience.Répétez les étapes 1.2.1-1.2.9 du protocole d’expérience 2D avec une culture cellulaire LLC. Après avoir compté les cellules, préparez 25 mL de la suspension cellulaire. Ensemencer 1 000 cellules par puits dans tous les puits dans 50 μL de DMEM dans une plaque de fond en U à faible liaison de 384 puits. Centrifuger à 40 × g pendant 30 s et agiter avec un agitateur à plaques à 250 tr/min pendant 1 min pour secouer les cellules des parois des puits jusqu’au fond. Placez les plaques dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO2 sur des couvercles de plaques en plastique supplémentaires pour éviter le chauffage inégal du fond de la plaque pendant 48 h. Expérience de culture cellulaire 3D – ajout des composés (jour 3)Surveiller les cellules dans les plaques par microscopie pour s’assurer que des sphéroïdes matures compacts se sont formés. Préparer une dilution en série des composés étudiés dans des plaques transparentes autoclavées en polypropylène. Dans ce cas, inclure un composé supplémentaire. Effectuez les solutions suivantes pour les mesures ponctuelles individuelles :Pour obtenir des solutions de gramicidine S de 175 μM et 350 μM, ajouter 1,8 μL de solution mère de 20 mM à 198,2 μL de DMEM et ajouter 3,6 μL de stock à 196,4 μL de DMEM en conséquence. Pour obtenir des solutions 175 μM et 350 μM de LMB002, forme « à anneau ouvert », ajouter 1 μL de solution mère de 40 mM à 199 μL de DMEM et ajouter 1,8 μL de stock à 198,2 μL de DMEM en conséquence. Pour obtenir des solutions 350 μΜ et 1 750 μM de LMB002, forme « fermée en anneau », ajouter 1,8 μL de solution mère de 40 mM à 198,2 μL de DMEM et ajouter 8,8 μL de mère à 191,2 μL de DMEM en conséquence. Effectuer trois répétitions supplémentaires pour obtenir quatre ensembles de chaque point de concentration. Acquérir des dilutions en série en prélevant 20 μL de chaque puits de départ, en les transférant dans le puits, avec 180 μL de DMEM, et en mélangeant soigneusement.REMARQUE: Le travail avec des composés photocommutables nécessite un réglage de l’éclairage pour empêcher la photoisomérisation arrière. Il est recommandé d’éteindre les lumières dans les armoires stériles. Obtenir les concentrations finales des composés dans les puits en transférant 20 μL des solutions préparées à chaque fois dans 128 puits contenant 50 μL de DMEM. Ajouter 20 μL de DMEM à chaque fois dans trois puits pour servir de contrôle. Couvrez les plaques avec du papier d’aluminium ou une couverture protectrice en plastique pour empêcher la photocommutation ou l’évaporation. Placez les plaques dans un incubateur de culture cellulaire sur des couvercles de plaques en plastique pour le temps d’incubation choisi. Expérience de culture cellulaire 3D – coloration et imagerie (jours 3-6)Préparer la solution de coloration par point temporel en ajoutant 13 μL de solution de calcéine AM 1 mM (concentration finale de 1 μM), 22 μL de solution Hoechst 33342 20 mM (concentration finale de 33 μM), 40 μL de solution PI 1 mM (concentration finale de 3 μM), 300 μL de FBS non stérile à 2 625 μL de 1x PBS non stérile. Préchauffez FBS et PBS au bain-marie à 37 °C pour éviter que les cellules ne subissent un choc thermique. Après incubation pendant différentes périodes avec les composés, ajouter 20 μL de solution de coloration par puits dans les puits qui ont été incubés avec des composés pendant 10 min. Incuber à 37 °C pendant 2 h. Effectuez une imagerie confocale en fluorescence à l’aide d’une lentille d’objectif 20x. Répéter la même procédure de coloration et d’imagerie pour les puits qui ont été incubés avec des composés pendant 24 (jour 4) et 72 (jour 6) h.REMARQUE: Dans cette expérience, la calcéine AM est utilisée comme troisième composant de la solution de coloration multicolore. Les images obtenues à partir d’expériences 2D et 3D sont analysées à l’aide du logiciel d’analyse d’images automatisé de l’instrument. Les cellules cocolorées avec des colorants Hoechst et iodure de propidium sont considérées comme necrotiquement mortes, et leur fraction en fonction de la concentration est utilisée pour calculer la valeur IC50 . Figure 2 : Exemple de cartes de plaques typiques pour les expériences de culture 2D. Les codes de couleur pour les composés et le contrôle sont indiqués. Les concentrations des composés testés (nombre à l’intérieur des puits) sont données en μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 2. Détermination de l’efficacité de la photocommutation chez un substitut tissulaire Assembler le train optique pour l’irradiation de l’échantillon comme illustré à la figure 3 (composé d’un câble optique provenant de la source lumineuse laser, d’une lentille à focale variable, d’une seringue avec un couvercle non transparent et d’une extrémité à coupe plate).En modifiant la distance focale et l’ouverture de la lentille, obtenir un faisceau de lumière plat d’un diamètre supérieur de 1 à 1,5 mm au diamètre intérieur de la seringue utilisée, mais toujours dans l’ouverture. Utilisez une seringue de 5 mL avec une extrémité coupée et un diamètre intérieur de 12,4 mm et recouverte d’un couvercle en plastique non transparent. À une puissance de sortie laser de 200 mW, régler la densité de puissance à la sortie du système optique à ~103 mW/cm2 mesurée avec un photomètre.REMARQUE : Toutes les opérations subséquentes doivent être effectuées dans une pièce sombre avec le minimum d’éclairage possible sur le lieu de travail. Préparer 3 mL de solution mère LMB002 (forme « à anneau fermé ») dans du PBS à une concentration de 1 mg/mL. Préparer un échantillon de tissu modèle chargé de la photoforme inactive de LMB002 dans un récipient en plastique. Dans une course typique, 5 g de viande de porc hachée fraîche sont mélangés mécaniquement avec 277 μL de solution mère LMB002 et 260 μL de PBS pour atteindre la concentration finale de 50 mg / kg dans l’échantillon, et le rapport tissu / PBS de ~ 9/1 (v / v). Remplissez la seringue avec l’échantillon préparé, en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles d’air à l’intérieur, et formez une surface plane à l’extrémité de l’exposition (coupe).NOTE: Le cylindre de l’échantillon dans la seringue doit occuper ~40 mm le long de l’axe. Irradier l’échantillon dans le train optique comme le montre la figure 3 pendant 9 min 44 s, correspondant à ~60 J/cm2 d’exposition. Préparer des tranches de l’échantillon de 4 mm d’épaisseur après l’exposition en le poussant hors de la seringue à l’aide du piston et en le coupant avec un scalpel. Peser et placer les tranches dans des tubes à essai séparés et les marquer par la distance moyenne (mm) de la surface irradiée. Préparer deux échantillons témoins (quantité optimale, 0,5-0,7 g) dans des tubes à essai : dans l’un, de la viande hachée mélangée à 10 % (volume) de PBS (54 μL), et dans l’autre, l’échantillon de tissu modèle obtenu à l’étape 2.4 irradié par une lumière laser de 500 mW pendant 10 min pour s’assurer que toutes les molécules LMB002 « fermées en anneau » sont converties en forme « à anneau ouvert ». Ajouter le mélange acétonitrile-eau (70 %/30 % v/v, complété par de l’acide trifluoroacétique (TFA) à 0,01 %, 1,4 mL/g) à chaque tranche et aux échantillons témoins. Bien mélanger le contenu à l’aide d’une tige de verre. Incuber à température ambiante pendant au moins 10 min et centrifuger les mélanges à 5220 x g pendant 20 min ou centrifuger à 20 x g pendant 30 min deux fois pour éliminer la matière insoluble et recueillir le surnageant. Recueillir soigneusement les surnageants (~0,7 mL) et les centrifuger à nouveau à 16 000 x g pendant 30 min. Recueillir les surnageants (~0,5 mL chacun) et les analyser par chromatographie liquide haute performance en phase inverse (CLHP RP) avec une colonne analytique C18, gradient linéaire A:B de 3,46 % B/min, débit de 2,0 mL/min et 100 μL de volume injecté. Enregistrer les chromatogrammes détectés par UV à 570 nm (détection de la forme « fermée à anneau ») et à 270 nm (détection de la forme « anneau ouvert »). Utiliser les échantillons témoins non irradiés (étape 2.4) et irradiés (étape 2.8) pour déterminer les temps de rétention spécifiques des deux photoformes (éluant A: aqueux 0,1 % TFA; éluant B: 90 % acétonitrile-eau, 0,1 % TFA) et étalonner la méthode. Déterminer les quantités réelles de photoformes LMB002 dans les échantillons analysés en utilisant les courbes d’étalonnage obtenues en prenant et en analysant les chromatogrammes des solutions LMB002 de concentrations connues. Pour l’étalonnage, préparer les solutions LMB002 « à anneau fermé » en diluant la solution mère (étape 2.3) avec un mélange acétonitrile-eau (70 %/30 % v/v complété par 0,01 % TFA) pour obtenir 0,36, 0,9 et 3,6 μg par 100 μL (le volume injecté); Le gradient et le débit de l’éluant sont les mêmes qu’à l’étape 2.12. Répétez l’expérience (étapes 2.4-2.12) trois fois et tracez le pourcentage normalisé de chaque photoforme sur la parcelle (pourcentage) en fonction de la distance (à partir de la surface du tissu irradié). Calculer les statistiques (c.-à-d. l’écart-type à chaque point de concentration). Figure 3 : Installation expérimentale pour déterminer l’efficacité de la photoconversion dans le tissu modèle. (A) Schéma et (B) photographie; 1, câble optique de la source lumineuse laser; 2, objectif à focale variable; et 3, un mélange de solution saline tamponnée au phosphate LMB002 de viande placé dans 4, une seringue avec un couvercle non transparent et une extrémité avant coupée (illustrée en (B) sans le couvercle). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 3. Détermination de l’efficacité anticancéreuse in vivo REMARQUE : Le calendrier et les critères d’évaluation des expériences sont illustrés à la figure 4. Les normes de soins aux animaux pendant la période de post-traitement devraient être conformes aux règles 3R – le logement devrait inclure une densité de cage appropriée et la disponibilité des ressources. Dans la mesure du possible, respectez les méthodes de manipulation des animaux non aversives telles que le tunnel ou les ventouses. Figure 4 : Calendrier de l’expérience thérapeutique in vivo. Désignation des groupes expérimentaux, détails du traitement, critères d’évaluation et calendriers d’analyse post mortem. Abréviations : LLC = carcinome pulmonaire de Lewis; IV = intraveineuse; SC = sous-cutanée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Préparation des cellules cancéreuses pour l’inoculation sous-cutanée (jour 0).Passage des cellules LLC dans DMEM (4,5 g / L de glucose) avec 10% FBS, 100 U / mL de pénicilline et 100 μg / mL de streptomycine à 37 ° C et 5% de CO2. Récoltez les cellules en utilisant une solution trypsine-EDTA à 0,05%, centrifugez et suspendez-les dans du DMEM sans sérum. Compter les cellules et déterminer leur viabilité à l’aide d’un hémocytomètre et d’un test d’exclusion du bleu de trypan. Préparer la suspension cellulaire finale à une concentration de 10 × 106 cellules/mL dans le mélange DMEM et Matrigel (1:1). Gardez la suspension sur glace avant l’injection. Inoculation cellulaire LLC (jour 0)Placez la souris C57BL/6NCrl femelle adulte (pesant ~20 g) dans la chambre d’induction de l’appareil d’anesthésie à l’isoflurane. Effectuez une sédation à 5% d’isoflurane et attendez que l’animal soit complètement inconscient. Retirer la fourrure de la zone d’inoculation cellulaire par rasage. Inoculer 5 × 105 cellules LLC dans ~100 μL de DMEM: mélange Matrigel (1: 1) dans le membre postérieur droit.REMARQUE : Dans la mesure du possible, respectez la pratique d’utilisation d’une seule aiguille. Administration de composés et photoirradiationREMARQUE: Dans les 5-8 jours post-inoculation, les animaux sont prêts pour le traitement lorsque leurs tumeurs sont palpables et ont atteint ~50-100 mm3 volume. Effectuer toutes les opérations ultérieures avec LMB002 et des souris traitées par ce composé dans des conditions semi-obscures (une lampe LED de 4 W à au moins 5 m du poste de travail).Dissoudre LMB002 (forme « fermée en anneau ») dans une solution saline physiologique stérile à une concentration de 1 mg/mL à la dose de 5 mg/kg (IV) pour obtenir des solutions homogènes bleu foncé. Avant l’irradiation, assemblez au hasard quatre groupes de huit animaux et retirez la fourrure de la tumeur et des zones voisines en se rasant. Placez une souris dans le support pour les injections intraveineuses et préchauffez la queue de l’animal dans un bain-marie à 37 °C pour rendre la veine de la queue visible.REMARQUE: Envisagez une analgésie préopératoire. Injecter le composé à 5 mL/kg dans la veine de la queue. Pour les deux groupes témoins, injecter 100 μL de solution saline (par voie intraveineuse) par animal (20 g de poids corporel). S’assurer que les animaux des deux groupes expérimentaux reçoivent le composé testé sous la photoforme inactive (1 mg/mL dans une solution saline).REMARQUE : Dans la mesure du possible, respectez la pratique d’utilisation d’une seule aiguille. Ensuite, 2 h 45 min après l’injection du composé, placez la souris sous anesthésie. Induire la sédation avec 3% -4% d’isoflurane dans l’oxygène. Maintenir l’anesthésie pendant 15 minutes avec 0,5% -1% d’isoflurane dans l’oxygène. Couvrez la souris avec un masque noir possédant un trou n’exposant que la zone tumorale à la lumière. Allumez le module de diode laser avec un laser de 650 nm et réglez la puissance du laser rouge sur 200 mW et celle du laser de guidage bleu/UV sur 2 mW.REMARQUE: Utilisez des lunettes de protection bleues lorsque l’appareil laser est allumé. Mesurer le flux lumineux du laser rouge (loin des souris) avec un photomètre et déterminer la distance du câble optique où le flux lumineux est de 100 mW/cm2. Fixez le câble sur un support pour vous assurer que la source de lumière est à la distance déterminée de la tumeur et que la lumière couvre toute la zone tumorale. Utilisez une lumière laser de guidage bleue / UV pendant cette procédure. Allumez le laser rouge pour irradier la zone tumorale pendant 20 min. Après l’irradiation, coupez le flux d’isoflurane, remettez l’animal dans sa cage et observez attentivement son état pendant les 30 minutes suivantes.REMARQUE: Après l’administration du composé, gardez les souris dans l’obscurité pendant 2 jours. Seul le cycle lumière-jour doit être modifié; Toutes les autres conditions de logement devraient rester inchangées. Observations post-traitementObservez les animaux quotidiennement et mesurez le poids et les dimensions de leurs tumeurs. Mesurer le volume tumoral et noter la progression de la nécrose.REMARQUE : Les normes de soins aux animaux pendant la période post-traitement doivent être conformes aux règles 3R – le logement doit inclure une densité de cage appropriée et la disponibilité des ressources. Utilisez les données recueillies à l’étape précédente pour évaluer la mortalité. Déterminez le taux de survie à l’aide de la procédure standard.REMARQUE: Les animaux doivent être sacrifiés et comptés comme morts lorsqu’ils révèlent des signes cliniques graves (perte de poids corporel de plus de 15%, ulcération tumorale ne guérit pas en 7 jours et vocalisation) ou dès que le volume tumoral atteint 2 500 mm3.