Valutazione in vitro e in vivo di composti biologicamente attivi fotocontrollati - potenziali farmaci candidati per la fotofarmacologia del cancro

La cura degli animali e le procedure sperimentali sono state eseguite seguendo le normative locali e internazionali per la conduzione di progetti di ricerca che coinvolgono animali da laboratorio (Legge dell’Ucraina “Sulla protezione degli animali dalla crudeltà”, Convenzione europea per la protezione degli animali vertebrati utilizzati a fini sperimentali e altri scopi scientifici (Convenzione europea, Strasburgo, 1986), Direttiva 2010/63 / UE sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici). Questo studio è approvato dalla Commissione di Bioetica della società Bienta. In questi esperimenti sono stati utilizzati topi C57BL/6NCrl (femmine adulte del peso di circa 20 g ciascuna). I materiali, i reagenti e le attrezzature specifici sono elencati nella tabella dei materiali. 1. Valutazione IC50 per LMB002 (forme “ring-closed” e “ring-open”) utilizzando colture cellulari 2D e 3D LLC Preparazione di tamponi e soluzioni madre dei compostiNota : preparare i buffer utilizzando le procedure standard. In alternativa, utilizzare soluzioni disponibili in commercio.Preparare 10x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) aggiungendo 14,2 g di Na 2 HPO 4, 2,4 g di KH 2 PO4, 80 g di NaCl e2g di KCl a 1 L di acqua distillata. Autoclave preparato 10x PBS e diluirlo in 1x soluzione aggiungendo 100 mL di soluzione 10x a 900 mL di acqua distillata. Quindi, conservare la soluzione a 4 °C. Preparare il PBS di Dulbecco (DPBS) aggiungendo 4,78 g di polvere DPBS a 1 L di acqua distillata. Mescolare la soluzione fino a quando tutto il solido si dissolve, controllare il pH utilizzando un pHmetro e regolarlo aggiungendo 1 M NaOH o 1 M HCl (pH 7,3-7,4). Dopo aver raggiunto il livello di pH desiderato, filtrare il fluido attraverso un filtro a vuoto da 0,22 μm in un armadio sterile. Conservare a 4 °C. Preparare 1 M soluzione tampone di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES) aggiungendo 238,3 g di HEPES a 1 L di acqua distillata. Regolare il pH della soluzione con 1 M NaOH fino a pH 7,5. Filtrare attraverso un filtro sottovuoto da 0,22 μm in un armadio sterile. Conservare a 4 °C. Preparare 1x soluzione di tripsina-EDTA (EDTA = acido etilendiamminotetraacetico) diluendo la soluzione 10x. Per fare ciò, aggiungere 5 ml di 10x Trypsin-EDTA a 45 mL di soluzione 1x PBS in un tubo sterile da 50 ml. Conservare a 4 °C. Preparare il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco aggiungendo 13,4 g di DMEM ad alto glucosio in polvere e 3,7 g di Na2CO3 a 1 L di acqua distillata in un cilindro graduato con un’asta di agitazione magnetica posta su una piastra di agitazione. Mescolare la soluzione fino a quando tutto il solido si dissolve, controllare il pH utilizzando un pHmetro e regolarlo aggiungendo 1 M NaOH o 1 M HCl (pH 7,3-7,4). Dopo aver raggiunto il pH desiderato, filtrare il fluido attraverso un filtro sottovuoto da 0,22 μm in un armadio sterile e conservare a 4 °C. Preparare il terreno completo DMEM aggiungendo 100 ml di siero bovino fetale (FBS), 10 ml di soluzione di penicillina-streptomicina, 10 ml di soluzione di L-glutammina e 10 ml di tampone HEPES 1 M a 900 ml di DMEM basico. Conservare a 4 °C. Preparare le soluzioni stock per i composti di prova.Per ciascun composto, pesare due lotti di 5,12 mg (ad esempio, LMB002) nella fotoforma chiusa ad anello in due tubi di microcentrifuga da 1,5 ml (uno con pareti trasparenti e l’altro nero non trasparente). Pesare 2,28 mg di controllo positivo (ad esempio, gramicidina S) in un tubo a parete extra-chiaro. Aggiungere 100 μL di DMSO puro a ciascun campione e vortice per 30 s. Fotoisomerizzare la soluzione madre (LMB002) nel tubo a parete trasparente dalla forma “ring-closed” a quella “ring-open” irradiando la soluzione con laser 660 nm (densità di potenza luminosa 0,6 W/cm2) con vortice per garantire una miscelazione accurata. Continua fino a quando il colore cambia visibilmente dal viola scuro al marrone chiaro. Proteggere dalla luce usando un foglio di alluminio. Esperimento di coltura cellulare 2D-semina delle cellule (giorno 1)Trasferire 10 mL del mezzo completo DMEM dal pallone T-75 con una coltura cellulare LLC a un tubo sterile da 15 ml. Aspirare il mezzo rimanente con una pompa per vuoto. Lavare la coltura cellulare con 5 ml di 1x DPBS e aspirare la soluzione con una pompa per vuoto. Coprire le cellule con 3 mL di soluzione 1x tripsina-EDTA e incubare il matraccio per 2-3 minuti a 37 °C in atmosfera al 5% di CO2 . Interrompere l’azione della tripsina aggiungendo 6 mL del mezzo DMEM (precedentemente trasferito in un tubo sterile) al pallone di coltura cellulare contenente 1x soluzione di tripsina-EDTA e pipettando più volte la sospensione per lavare le cellule dalle pareti del pallone di coltura cellulare. Trasferire la sospensione in un tubo da 15 ml e centrifugare a 200 × g per 4 minuti. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante con una pompa per vuoto. Evitare di toccare il pellet cellulare sul fondo del tubo. Risospendere le cellule aggiungendo 2 ml di terreno completo DMEM fresco e pipettaggio più volte. Contare le cellule campionando circa 15 μL della sospensione in una provetta da 0,5 ml, aggiungendo 15 μL di blu tripano allo 0,4% e trasferendo la miscela ottenuta in una camera di conteggio delle cellule. Dopo il conteggio, preparare 25 ml della sospensione cellulare per punto temporale. Semina 5.000-10.000 (8.000 in media) cellule LLC / pozzetto in 200 μL di DMEM nei 60 pozzetti centrali di una piastra a 96 pozzetti con fondo chiaro e pareti nere non trasparenti. Riempire i restanti 36 pozzetti con DMEM puro. Posizionare le piastre in un incubatore per colture cellulari per una notte a 37 °C e al 5% di CO2. Utilizzare coperchi di piastre di plastica sotto per evitare il riscaldamento irregolare della piastra inferiore. Esperimento di coltura cellulare 2D – aggiunta dei composti (giorno 2)Monitorare le cellule mediante microscopia ottica nelle piastre fino a quando le cellule hanno raggiunto il 70% -80% di confluenza. Aspirare il mezzo dai pozzetti con una pompa per vuoto in un armadio sterile. Aggiungere 100 μL del mezzo DMEM fresco preriscaldato e posizionare le piastre in un incubatore di coltura cellulare. Preparare diluizioni seriali dei composti in esame e controllo positivo in piastre trasparenti autoclavate in polipropilene. Effettuare le seguenti soluzioni per le misurazioni dei singoli punti temporali:NOTA: Iniziare con le scorte di DMSO e diluire con DMEM, ma non superare l’1% v/v di DMSO nella concentrazione finale più elevata.Per ottenere una soluzione 128 μM di gramicidina S, aggiungere 1,3 μL di 20 mM di soluzione madre a 198,7 μL di DMEM. Per ottenere una soluzione da 256 μM di LMB002, in forma “ring-open”, aggiungere 1,3 μL di soluzione 40 mM a 198,7 μL di DMEM. Per ottenere una soluzione da 512 μM di LMB002, in forma “ring-closed”, aggiungere 2,6 μL di soluzione madre da 40 mM a 197,4 μL di DMEM. Eseguire tre ripetizioni aggiuntive per ottenere quattro serie di ciascun punto di concentrazione. Preparare una serie di doppia diluizione aspirando 100 μL da ciascun pozzetto di partenza, trasferendo in un pozzetto con 100 μL di DMEM e mescolando accuratamente.NOTA: lavorare con composti fotocommutabili richiede la regolazione dell’illuminazione per evitare la fotoisomerizzazione posteriore. Si consiglia di spegnere la luce in armadi sterili. Ottenere le concentrazioni finali dei composti nei pozzetti (5-150 μM) trasferendo 100 μL delle soluzioni preparate ogni volta in 56 pozzetti con 100 μL di DMEM precedentemente aggiunto. Aggiungere 100 μL di DMEM ogni volta in quattro pozzetti per fungere da controllo negativo. Piastre di copertura con foglio di alluminio o coperchio protettivo in plastica non trasparente per impedire la commutazione incontrollata della foto. Posizionare le piastre in un incubatore per colture cellulari a 37 °C (utilizzando sotto i coperchi delle piastre di plastica supplementari) per il tempo di incubazione scelto (10 min, 60 min, 24 h o 72 h). Esperimento di coltura cellulare 2D – colorazione e imaging (giorni 2-5)Dopo l’incubazione con composti per periodi diversi, aggiungere 50 μL della soluzione colorante per pozzetto alle piastre che sono state incubate con composti per 10 e 60 minuti. Incubare le piastre a 37 °C per 20 min.NOTA: Preparare le soluzioni di colorazione per punto temporale aggiungendo 8 μL di soluzione Hoechst 33342 da 20 mM (la concentrazione finale è 5 μM), 32,5 μL di soluzione di ioduro di propidio (PI) da 1 mM (concentrazione finale è 1 μM) e 650 μL di FBS non sterile a 5.810 μL di 1x PBS non sterile. Preriscaldare FBS e PBS a bagnomaria a 37 °C per evitare che le cellule subiscano uno shock termico. Eseguite l’imaging a fluorescenza automatizzato utilizzando un obiettivo 20x. Ripetere la stessa procedura di colorazione e imaging (fasi 1.4.1 -1.4.2) per le piastre che sono state incubate con composti per 24 (giorno 3) e 72 (giorno 5) h.NOTA: le tipiche mappe 2D delle lastre sono illustrate nella Figura 2. Esperimento di coltura cellulare 3D – seminare le cellule (giorno 1)NOTA: i passaggi di questa sezione sono identici a quelli descritti per la preparazione dell’esperimento 2D della coltura cellulare, l’incubazione con i composti testati e l’imaging (passaggi 1.1-1.4). Tuttavia, in questo caso, le cellule vengono preparate come sferoidi maturi compatti in una piastra inferiore a U a bassissima adesione a 384 pozzetti con pareti nere e non trasparenti. L’uso di una piastra di queste dimensioni consente di confrontare due composti in un esperimento.Ripetere i passaggi 1.2.1-1.2.9 del protocollo dell’esperimento 2D con una coltura cellulare LLC. Dopo aver contato le cellule, preparare 25 ml della sospensione cellulare. Seminare 1.000 cellule per pozzetto in tutti i pozzetti in 50 μL di DMEM in una piastra con fondo a U a 384 pozzetti, a basso legame. Centrifugare a 40 × g per 30 s e agitare con uno scuotitore a piastre a 250 giri / min per 1 minuto per scuotere le cellule dalle pareti dei pozzetti verso il basso. Posizionare le piastre in un incubatore a 37 °C e al 5% di CO2 sopra i coperchi delle piastre di plastica supplementari per evitare il riscaldamento irregolare del fondo della piastra per 48 ore. Esperimento di coltura cellulare 3D – aggiunta dei composti (giorno 3)Monitorare le cellule nelle piastre al microscopio per assicurarsi che si siano formati sferoidi maturi compatti. Preparare una diluizione seriale dei composti studiati in lastre trasparenti autoclavate in polipropilene. In questo caso, includere un composto aggiuntivo. Effettuare le seguenti soluzioni per le misurazioni dei singoli punti temporali:Per ottenere soluzioni da 175 μM e 350 μM di gramicidina S, aggiungere 1,8 μL di soluzione madre da 20 mM a 198,2 μL di DMEM e aggiungere 3,6 μL di stock a 196,4 μL di DMEM per corrispondenza. Per ottenere soluzioni da 175 μM e 350 μM di LMB002, in forma “ring-open”, aggiungere 1 μL di soluzione madre da 40 mM a 199 μL di DMEM e aggiungere 1,8 μL di stock a 198,2 μL di DMEM corrispondentemente. Per ottenere soluzioni da 350 μΜ e 1.750 μM di LMB002, in forma “ad anello chiuso”, aggiungere 1,8 μL di soluzione madre da 40 mM a 198,2 μL di DMEM e aggiungere 8,8 μL di stock a 191,2 μL di DMEM per corrispondenza. Eseguire tre repliche aggiuntive per ottenere quattro serie di ciascun punto di concentrazione. Acquisire diluizioni seriali prelevando 20 μL da ciascun pozzetto di partenza, trasferendolo nel pozzetto, con 180 μL di DMEM, e mescolando accuratamente.NOTA: lavorare con composti fotocommutabili richiede la regolazione dell’illuminazione per evitare la fotoisomerizzazione posteriore. Si consiglia di spegnere le luci negli armadi sterili. Ottenere le concentrazioni finali di composti nei pozzetti trasferendo 20 μL delle soluzioni preparate ogni volta in 128 pozzetti contenenti 50 μL di DMEM. Aggiungere 20 μL di DMEM ogni volta in tre pozzetti per fungere da controllo. Coprire le piastre con un foglio di alluminio o una copertura protettiva in plastica per evitare la fotocommutazione o l’evaporazione. Posizionare le piastre in un incubatore di coltura cellulare su coperchi di piastre di plastica per il tempo di incubazione scelto. Esperimento di coltura cellulare 3D – colorazione e imaging (giorni 3-6)Preparare la soluzione colorante per punto temporale aggiungendo 13 μL di soluzione 1 mM di calceina AM (la concentrazione finale è 1 μM), 22 μL di soluzione 20 mM Hoechst 33342 (la concentrazione finale è 33 μM), 40 μL di 1 mM di soluzione PI (concentrazione finale è 3 μM), 300 μL di FBS non sterile a 2.625 μL di 1x PBS non sterile. Preriscaldare FBS e PBS a bagnomaria a 37 °C per evitare che le cellule subiscano uno shock termico. Dopo l’incubazione per diversi periodi con i composti, aggiungere 20 μL della soluzione colorante per pozzetto ai pozzetti che sono stati incubati con composti per 10 minuti. Incubare a 37 °C per 2 ore. Eseguire l’imaging confocale a fluorescenza utilizzando un obiettivo 20x. Ripetere la stessa procedura di colorazione e imaging per i pozzi che sono stati incubati con composti per 24 (giorno 4) e 72 (giorno 6) h.NOTA: In questo esperimento, calceina AM viene utilizzata come terzo componente della soluzione di colorazione multicolore. Le immagini ottenute da esperimenti 2D e 3D vengono analizzate utilizzando il software di analisi automatica delle immagini dello strumento. Le cellule co-colorate con coloranti Hoechst e ioduro di propidio sono considerate necroticamente morte e la loro frazione in funzione della concentrazione viene utilizzata per calcolare il valore IC50 . Figura 2: Esempio di mappe tipiche delle lastre per gli esperimenti di coltura 2D. Sono indicati i codici colore per i composti e il controllo. Le concentrazioni dei composti testati (numeri all’interno dei pozzetti) sono indicate in μM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. 2. Determinazione dell’efficienza di fotocommutazione in un surrogato tissutale Assemblare il treno ottico per l’irradiazione del campione come mostrato nella figura 3 (costituito da un cavo ottico dalla sorgente di luce laser, una lente con lunghezza focale variabile, una siringa con un coperchio non trasparente e un’estremità a taglio piatto).Modificando la lunghezza focale e l’apertura della lente, ottenere un fascio di luce piatto con un diametro maggiore di 1-1,5 mm rispetto al diametro interno della siringa utilizzata ma che sia ancora, per quanto possibile, all’interno dell’apertura. Utilizzare una siringa da 5 mL con un’estremità tagliata e un diametro interno di 12,4 mm ed è coperta da un coperchio di plastica non trasparente. Con una potenza di uscita laser di 200 mW, impostare la densità di potenza all’uscita del sistema ottico su ~103 mW/cm2 misurata con un fotometro.NOTA: Tutte le operazioni successive devono essere eseguite in una stanza buia con la minima illuminazione possibile del posto di lavoro. Preparare 3 mL di LMB002 (forma “ring-closed”) soluzione madre in PBS con una concentrazione di 1 mg/ml. Preparare un campione di tessuto modello caricato con la fotoforma inattiva di LMB002 in un contenitore di plastica. In una corsa tipica, 5 g di carne di maiale macinata fresca vengono miscelati meccanicamente con 277 μL di soluzione madre LMB002 e 260 μL di PBS per raggiungere la concentrazione finale di 50 mg / kg nel campione e il rapporto tessuto/PBS di ~ 9/1 (v / v). Riempire la siringa con il campione preparato, assicurandosi che non ci siano bolle d’aria all’interno e formare una superficie piana all’estremità dell’esposizione (taglio).NOTA: Il cilindro del campione nella siringa deve occupare ~40 mm lungo l’asse. Irradiare il campione nel treno ottico come mostrato nella figura 3 per 9 min 44 s, corrispondente a ~60 J/cm2 di esposizione. Preparare fette di campione spesse 4 mm dopo l’esposizione spingendolo fuori dalla siringa usando il pistone e tagliandolo con un bisturi. Pesare e collocare le fette in provette separate e contrassegnarle in base alla distanza media (mm) dalla superficie irradiata. Preparare due campioni di controllo (quantità ottimale, 0,5-0,7 g) in provette: in uno, carne macinata mescolata con il 10% (volume) di PBS (54 μL), e nell’altro, il campione di tessuto modello ottenuto nella fase 2.4 irradiato da 500 mW di luce laser per 10 minuti per garantire che tutte le molecole LMB002 “ring-closed” siano convertite nella forma “ring-open”. Aggiungere la miscela acetonitrile-acqua (70%/30% v/v, integrata con acido trifluoroacetico (TFA) allo 0,01%, 1,4 ml/g) a ciascuna fetta e ai campioni di controllo. Mescolare accuratamente il contenuto usando una bacchetta di vetro. Incubare a temperatura ambiente per almeno 10 minuti e centrifugare le miscele a 5220 x g per 20 minuti o centrifugare a 20 x g per 30 minuti due volte per rimuovere il materiale insolubile e raccogliere il surnatante. Raccogliere con cura i surnatanti (~0,7 ml) e centrifugarli nuovamente a 16.000 x g per 30 minuti. Raccogliere i surnatanti (~0,5 ml ciascuno) e analizzarli mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni a fase inversa (RP HPLC) con colonna analitica C18, gradiente lineare A:B del 3,46% B/min, portata 2,0 ml/min e 100 μL di volume iniettato. Registrare i cromatogrammi rilevati UV a 570 nm (rilevamento della forma “ring-closed”) e 270 nm (rilevamento della forma “ring-open”). Utilizzare i campioni non irradiati (fase 2.4) e di controllo irradiati (fase 2.8) per determinare i tempi specifici di ritenzione di entrambe le fotoforme (eluente A: acquoso 0,1% TFA; eluente B: 90% acetonitrile-acqua, 0,1% TFA) e calibrare il metodo. Determinare le quantità effettive di fotoforme LMB002 nei campioni analizzati utilizzando le curve di calibrazione ottenute prelevando e analizzando i cromatogrammi delle soluzioni LMB002 di concentrazioni note. Per la taratura, preparare le soluzioni “ring-closed” LMB002 diluendo la soluzione madre (fase 2.3) con miscela acetonitrile-acqua (70%/30% v/v integrata con 0,01% TFA) per ottenere 0,36, 0,9 e 3,6 μg per 100 μL (il volume iniettato); Il gradiente dell’eluente e la portata sono gli stessi del punto 2.12. Ripetere l’esperimento (punti 2.4-2.12) tre volte e tracciare la percentuale normalizzata di ciascuna fotoforma sul grafico (percentuale) rispetto alla distanza (dalla superficie del tessuto irradiato). Calcolare le statistiche (cioè la deviazione standard in ogni punto di concentrazione). Figura 3: Configurazione sperimentale per determinare l’efficienza della fotoconversione nel tessuto modello. (A) Schema e (B) fotografia; 1, cavo ottico dalla sorgente di luce laser; 2, obiettivo con lunghezza focale variabile; e 3, miscela salina tritata-LMB002-fosfato-tampone posto in 4, una siringa con un coperchio non trasparente e frontend tagliato (mostrato in (B) senza coperchio). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. 3. Determinazione dell’efficacia antitumorale in vivo NOTA: la pianificazione e gli endpoint dell’esperimento sono illustrati nella Figura 4. Gli standard di cura degli animali nel periodo successivo al trattamento dovrebbero essere conformi alle regole 3R: l’alloggiamento dovrebbe includere un’adeguata densità della gabbia e la disponibilità di risorse. Quando possibile, attenersi a metodi di manipolazione degli animali non avversivi come tunnel o coppettazione. Figura 4: Calendario per l’esperimento terapeutico in vivo . Designazione dei gruppi sperimentali, dettagli della terapia, endpoint e programmi di analisi post mortem . Abbreviazioni: LLC = carcinoma polmonare di Lewis; IV = endovenosa; SC = sottocutaneo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Preparazione delle cellule tumorali per l’inoculazione sottocutanea (giorno 0).Far passare le cellule LLC in DMEM (4,5 g / L glucosio) con 10% FBS, 100 U / mL penicillina e 100 μg / mL streptomicina a 37 ° C e 5% CO2. Raccogliere le cellule utilizzando una soluzione di tripsina-EDTA allo 0,05%, centrifugare e sospendere in DMEM senza siero. Contare le cellule e determinare la loro vitalità utilizzando un emocitometro e un test di esclusione del blu di tripano. Preparare la sospensione cellulare finale con concentrazione 10 × 106 cellule/ml in DMEM e Matrigel mix (1:1). Mantenere la sospensione sul ghiaccio prima dell’iniezione. Inoculazione cellulare LLC (giorno 0)Posizionare il topo femmina adulto C57BL/6NCrl (del peso di ~20 g) nella camera di induzione della macchina per anestesia isoflurano. Eseguire la sedazione al 5% di isoflurano e attendere che l’animale sia completamente incosciente. Rimuovere la pelliccia dall’area di inoculazione cellulare con la rasatura. Inoculare 5 × 105 cellule LLC in ~100 μL di DMEM: Matrigel (1:1) miscela nell’arto posteriore destro.NOTA: Quando possibile, attenersi alla pratica dell’uso di un singolo ago. Somministrazione di composti e fotoirradiazioneNOTA: In 5-8 giorni dopo l’inoculazione, gli animali sono pronti per il trattamento quando i loro tumori sono palpabili e hanno raggiunto ~ 50-100 mm3 volume. Eseguire tutte le operazioni successive con LMB002 e topi trattati con questo composto in condizioni di semi-buio (una lampada LED da 4 W ad almeno 5 m dal posto di lavoro).Sciogliere LMB002 (forma “ring-closed”) in soluzione fisiologica sterile ad una concentrazione di 1 mg/ml per la dose di 5 mg/kg (IV) per ottenere soluzioni omogenee blu scuro. Prima dell’irradiazione, assemblare casualmente quattro gruppi di otto animali e rimuovere la pelliccia dal tumore e dalle aree vicine radendosi. Inserire un topo nel supporto per iniezioni endovenose e preriscaldare la coda dell’animale a bagnomaria a 37 °C per rendere visibile la vena caudale.NOTA: Considerare l’analgesia preoperatoria. Iniettare il composto a 5 ml/kg nella vena caudale. Per i due gruppi di controllo, iniettare 100 μL di soluzione salina (per via endovenosa) per animale (20 g di peso corporeo). Assicurarsi che gli animali nei due gruppi sperimentali ricevano il composto testato nella fotoforma inattiva (1 mg / ml in soluzione salina).NOTA: Quando possibile, attenersi alla pratica dell’uso di un singolo ago. Quindi, 2 h 45 minuti dopo l’iniezione del composto, posizionare il topo in anestesia. Indurre sedazione con isoflurano al 3%-4% in ossigeno. Mantenere l’anestesia per 15 minuti con isoflurano 0,5% -1% in ossigeno. Coprire il topo con una maschera nera che possiede un foro che espone solo l’area del tumore alla luce. Accendere il modulo diodo laser con un laser da 650 nm e impostare la potenza del laser rosso su 200 mW e del laser a guida blu/UV su 2 mW.NOTA: Utilizzare occhiali protettivi blu quando il dispositivo laser è acceso. Misurare il flusso luminoso dal laser rosso (lontano dai mouse) con un fotometro e determinare la distanza dal cavo ottico in cui il flusso luminoso è di 100 mW/cm2. Fissare il cavo su un supporto per assicurarsi che la sorgente luminosa sia alla distanza determinata dal tumore e che la luce copra l’intera area tumorale. Utilizzare la luce laser a guida blu / UV durante questa procedura. Accendere il laser rosso per irradiare l’area tumorale per 20 minuti. Dopo l’irradiazione, spegnere il flusso di isoflurano, riportare l’animale nella sua gabbia e osservare attentamente le sue condizioni nei successivi 30 minuti.NOTA: Dopo la somministrazione composta, tenere i topi al buio per 2 giorni. Solo il ciclo luce-giorno deve essere modificato; Tutte le altre condizioni abitative dovrebbero rimanere invariate. Osservazioni post-trattamentoOsserva quotidianamente gli animali e misura il peso e le dimensioni dei loro tumori. Misurare il volume del tumore e notare la progressione della necrosi.NOTA: Gli standard di cura degli animali nel periodo post-trattamento devono essere conformi alle regole 3R: l’alloggiamento dovrebbe includere un’adeguata densità della gabbia e la disponibilità di risorse. Utilizzare i dati raccolti nel passaggio precedente per valutare la mortalità. Determinare il tasso di sopravvivenza utilizzando la procedura standard.NOTA: Gli animali devono essere sacrificati e contati come morti quando rivelano gravi segni clinici (perdita di peso corporeo superiore al 15%, ulcerazione tumorale non guarisce in 7 giorni e vocalizzazione) o non appena il volume del tumore raggiunge 2.500 mm3.