Dieses Protokoll stellt eine Reihe von Experimenten vor, die für die Evaluierung von photoschaltbaren Antikrebspeptiden verwendet wurden, die für das präklinische Screening solcher Verbindungen verwendet werden können. Dazu gehören die Bewertung der Zytotoxizität in 2D- und 3D-Zellkulturen, die Bewertung der Ex-vivo-Photoisomerisierungseffizienz (Modellgewebe) und der In-vivo-Wirksamkeit.
Photokontrollierte, biologisch aktive Verbindungen sind eine aufstrebende Klasse von “intelligenten” Wirkstoffkandidaten. Zusätzliche Sicherheit in der systemischen Chemotherapie bieten sie durch ihre präzise raumzeitliche Aktivierung, indem sie ein gutartiges, nicht ionisierbares Licht auf eine bestimmte Stelle im Körper des Patienten lenken. In dieser Arbeit wird eine Reihe von Methoden vorgestellt, um die in vitro Potenz und ex vivo Effizienz der Photoaktivierung von photokontrollierten, biologisch aktiven Verbindungen sowie die in vivo Wirksamkeit in frühen Stadien der Arzneimittelentwicklung zu bewerten. Die Methodik wird auf zytotoxische Peptide gegen Krebs angewendet, nämlich auf die Diarylethen-haltigen Analoga eines bekannten Antibiotikums, Gramicidin S. Die Experimente werden mit 2D- (adhärente Zellen) und 3D-Zellkulturen (Sphäroide) einer Krebszelllinie (Lewis-Lungenkarzinom, LLC), Lebendgewebe-Surrogate (Schweinefleischhack) und einem Allotransplantat-Krebsmodell (subkutane LLC) in immunkompetenten Mäusen durchgeführt. Die Auswahl der wirksamsten Verbindungen und die Abschätzung realistischer phototherapeutischer Fenster erfolgen mittels automatisierter Fluoreszenzmikroskopie. Die Photoaktivierungseffizienz bei unterschiedlichen Beleuchtungsregimen wird in unterschiedlichen Tiefen in einem Modellgewebe bestimmt, und die optimale Lichtdosis wird im abschließenden therapeutischen In-vivo-Experiment angewendet.
Photokontrollierte biologisch aktive Verbindungen haben sich in den letzten Jahrzehnten als vielversprechender Bestandteil sicherer Chemotherapien für menschliche Krankheiten und zur gezielten Eradikation bösartiger solider Tumore herausgestellt1. Diese Verbindungen enthalten reversibel photoisomerisierbare Fragmente (molekulare Photoschalter) und können bei Bestrahlung mit Licht unterschiedlicher Wellenlängen zwischen inaktiven und aktiven Photoisomeren umschalten.
Im Vergleich zu ihren nicht photokontrollierbaren Analoga können photogesteuerte Medikamente sicherer sein, da sie in weniger aktiver und im Wesentlichen ungiftiger Form systemisch in den Körper des Patienten eingeführt werden können und dann nur bei Bedarf durch Licht aktiviert werden, z. B. bei Tumoren, Geschwüren und Wunden. Obwohl in neueren wissenschaftlichen Arbeiten 2,3,4,5,6,7 mehrere spannende Demonstrationen solcher molekularen Wirkstoffprototypen zu finden sind, existiert das Gebiet der klinischen Photopharmakologie – eine Anwendung von zugelassenen Kombinationen aus Arzneimitteln/Medizinprodukten/Krankheiten – nicht. Die Photopharmakologie befindet sich noch in der Phase der Wirkstoffforschung, und systematische präklinische Studien sind nicht bekannt.
Erst kürzlich konnten wir den in vivo Sicherheitsvorteil für einige photokontrollierte Antikrebspeptide nachweisen, nämlich die Analoga des Peptidantibiotikums Gramicidin S8. Diese photokontrollierten Derivate enthalten einen Diarylethen-Photoschalter (DAE), der reversible photoinduzierte Transformationen zwischen den sogenannten rotlichterzeugten “ringoffenen” und UV-erzeugten “ringgeschlossenen” Photoformen durchläuft (dargestellt in Abbildung 1 für eines der Derivate, Verbindung LMB002).
Abbildung 1: Photokontrolliertes zytotoxisches Peptid LMB002 und seine Photoisomerisierung. Das Diarylethen-Fragment ist rot dargestellt. Abkürzung: DAE = Diarylethen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Das Auffinden von Treffern und die Durchführung einer Hit-to-Lead-Optimierung erfordern häufig ein In-vitro– und In-vivo-Screening geeigneter Substanzbibliotheken 9,10. Hier demonstrieren wir eine Methodik, die für das systematische Hochdurchsatz-Screening der Zytotoxizität photokontrollierter Verbindungen geeignet ist. Wir bestimmen auch die Photoisomerisierungseffizienz, schätzen die Lichtdosis in Modellgeweben ab und bewerten die In-vivo-Wirksamkeit der leistungsstärksten Kandidaten. Der Ansatz steht im Einklang mit bioethischen und tierpflegerischen Überlegungen.
In dieser Arbeit werden traditionelle präklinische Methoden modifiziert, um die unkontrollierte Photoisomerisierung der getesteten Substanzen zu vermeiden. Das übergeordnete Ziel der Anwendung dieser modifizierten Methoden besteht darin, eine allgemeine Strategie zu entwickeln, die unkompliziert und schnell ist und statistisch signifikante Daten liefert, um In-vitro-Aktivitäten zuverlässig zu vergleichen und die In-vivo-Wirksamkeitstests von photoschaltbaren Verbindungen für die Identifizierung und Weiterentwicklung von Leitstrukturen zu rationalisieren.
Die Strategie besteht aus drei aufeinander aufbauenden Schritten. Der erste Schritt umfasst die Bestimmung von IC 50 (apparent50 % cell viability) in seriellen Verdünnungen für die aktiven und inaktiven Photoformen ausgewählter photokontrollierter biologisch aktiver Verbindungen unter Verwendung von zweidimensionalen (2D, Monolayer) und dreidimensionalen (3D, sphäroid) Zellkulturen und konfokaler automatisierter Hochdurchsatz-Fluoreszenzmikroskopie. Phototherapeutische Fenster werden in Bezug auf die IC50-Differenz zwischen den beiden Photoformen verglichen und die leistungsstärksten Kandidaten ausgewählt. Es gibt keinen spezifischen Vorteil bei der Toxizitätsbewertung durch automatisierte Mikroskopie und andere Zytotoxizitäts-Screening-Plattformen (Assays)11; Komplexere zellbasierte Tumormodelle12 könnten in diesem Stadium leicht implementiert werden.
Für die in Schritt 1 ausgewählten Verbindungen besteht der zweite Schritt darin, ihre Photoschalteffizienz innerhalb des Gewebes in Abhängigkeit von der Tiefe von der bestrahlten Gewebeoberfläche aus realistisch abzuschätzen, indem die Photoschalteffizienz der weniger aktiven Photoformen in einem Gewebesurrogat mittels UV-detektierter Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) von bestrahlten Probenextrakten quantifiziert wird. In vivo konnte die Effizienz der Photoschaltung untersucht werden, aber wir schlagen vor, ein einfaches Gewebesurrogat zu verwenden – Schweinehackfleisch. Wir haben die Validität dieses Ansatzes getestet. Wir haben die Umwandlung unserer photoschaltbaren Verbindungen in vivo an einem Krebsmodell einer Maus gemessen und ungefähr die gleiche Photokonversion in einer Tiefe beobachtet, die in früheren Experimenten mit Mäusen8 gemessen wurde. Jedes geeignete alternative künstliche Gewebe13, 3D-biogedrucktes Gewebe/Organ14, Biopsiematerialien oder ein anderes ausgenommenes tierisches Material könnte verwendet werden. Dieses Setup ist jedoch ein guter Kompromiss, da es wirtschaftlich, schnell und ethisch vertretbar ist.
Der dritte Schritt ist die Bestimmung der in vivo Krebswirksamkeit in einem murinen Krebsmodell. Für dieses Experiment werden die Verbindungen ausgewählt, die in den In-vitro-Experimenten überlegene Eigenschaften aufweisen und in einer Tiefe von mindestens 1-1,5 cm in den Modellgeweben effizient photoschalten.
Dieses Protokoll kann auf Verbindungen angewendet werden, die verschiedene Arten von Photoschaltern besitzen, vorausgesetzt, ihre Photoformen (oder ihre photostationären Zustände, PSS) sind für eine angemessene Zeit (einige Tage oder länger) stabil. Zur Veranschaulichung wird ein zuvor beschriebener DAE-abgeleiteter LMB00215 verwendet. Die LMB002-Fotoformen sind thermisch stabil und können bei −20 °C mindestens ein Jahr lang gelagert werden, ohne dass es zu einer wesentlichen Verschlechterung kommt. Lewis-Lungenkarzinom-Zellen (LLC) werden für diese In-vitro- und In-vivo-Demonstration ausgewählt, wobei dem Zelltyp keine Einschränkungen auferlegt werden. LLC-Zellen sind adhärent, leicht in 3D kultivierbar und werden zur Erzeugung von Tumoroiden verwendet (wie in Referenz16 beschrieben). Im lebenden Organismus LLC-Zellen werden zur Modellierung von Metastasierungsprozessen verwendet und können nach subkutaner Injektion leicht solide Tumore in immunkompetenten Mäusen erzeugen. Diese In-vivo-Methodik kann universell auf andere Krebsmodelle angewendet werden17,18. Die detaillierte Umsetzung dieser Strategie wird im Folgenden beschrieben.
Photokontrollierte Verbindungen sind beispiellos in der Arzneimittelentwicklung; Es wurden jedoch keine Methoden für deren präklinische und klinische Bewertung etabliert. Das nächste Monotherapie-Analogon, die photodynamische Therapie (PDT), ist die Behandlungsmodalität für den klinischen Einsatz, die von vielen Ländern gegen Krebs eingesetzt wird und sich in der Entwicklung für andere Indikationen befindet19,20. Ähnlich wie bei der Photopharmakologie basiert auch die PDT auf der Verwendung von Licht zur Aktivierung der bioaktiven Substanz (Singulettsauerstoff). Daher können einige experimentelle Methoden, die für präklinische und klinische Studien in der PDT verwendet werden, für die Photopharmakologie übernommen werden. So sind beispielsweise Lichtquellen, Lichtverabreichungsansätze und Medizinprodukte für die PDT gut entwickelt und zugelassen. Sie können direkt für die Bewertung von photokontrollierten Medikamenten verwendet werden. PDT und Photopharmakologie unterscheiden sich jedoch stark voneinander4, was die Notwendigkeit rechtfertigt, spezifische Methoden für letztere zu etablieren.
Erstens ist die nicht aktivierte Substanz in PDT (Sauerstoff) in lebenden Geweben immer in ungiftigen Konzentrationen vorhanden. Im Gegensatz dazu können nicht aktivierte photokontrollierte biologisch aktive Verbindungen eine Restaktivität und unerwünschte Toxizität aufweisen. Daher sollten ideale photopharmakologische Arzneimittel in ihrer verabreichten Form eine minimierte biologische Aktivität aufweisen und in ihrer lichterzeugten Form hochaktiv sein, das “phototherapeutische Fenster”21 muss so groß wie möglich sein. Die Suche nach dem Hit und die Durchführung der Hit-to-Lead-Optimierung erfordern die Identifizierung geeigneter Verbindungen und das Screening relativ großer Bibliotheken bereits in frühen Stadien der Arzneimittelentwicklung. Hier schlugen wir eine automatisierte konfokale Hochdurchsatz-Fluoreszenzmikroskopie vor, um effiziente photoschaltende Verbindungen zu identifizieren.
Die gewählte Methode zur Bewertung der Zytotoxizität ermöglicht eine einfache Umsetzung der wichtigsten Anforderung – der Aufrechterhaltung des PSS oder der Stabilität des sichtbar-lichtempfindlichen Photoisomers. Dies liegt daran, dass bei der Implementierung die Lichteinwirkung minimiert wird. Daher sollten bei der Auswahl alternativer Methoden automatisierte Methoden bevorzugt werden. Dieser Ansatz ist zuverlässig und informativ. Die Verwendung von 3D-Zellkulturen (Sphäroide) in diesem Stadium ermöglicht ein ganzheitliches Verständnis der Reaktion der Zelle auf die Behandlung in einer realistischeren gewebeähnlichen Mikroumgebung. Darüber hinaus können mit der Mikroskopie als direkte Methode wertvolle Einblicke in den Wirkmechanismus der Verbindungen gewonnen werden. Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie mit geeignetem Färbeprotokoll ermöglicht die visuelle Beurteilung der Morphologie der Zellen und Sphäroide. Auch wichtige Details zum Zelltod und Veränderungen im Inneren der Zellen können detektiert werden.
Zweitens erfordert eine leichte Anwendung eine sorgfältige Auswahl der Lichtdosierung. Bei der PDT ist eine leichte Überdosierung extrem schädlich für das Gewebe22. Eine photopharmakologische Therapie kann bei übermäßiger Lichtbestrahlung vorteilhaft sein. Die Obergrenze der aktivierten Substanz wird durch die verabreichte Dosis der nicht aktivierten Substanz und deren Pharmakokinetik definiert. Die Lichtdosierung ist jedoch immer noch ein Problem in der Photopharmakologie. Es sollte darauf geachtet werden, dass die Bestrahlungsleistungsdichte und die Einwirkzeit nicht geringer sind als die Anforderung an die Therapie. Prinzipiell kann die Bildung der aktivierten Substanz in vivo überwacht werden. Aus bioethischen Gründen schlugen wir jedoch ein Experiment mit einem Modellgewebe (frisches Hackfleisch) vor, das mit der nicht aktivierten Verbindung15 gemischt wurde. Dieses Experiment ist einfach und kann modifiziert werden, um verschiedene Lichtquellen zu verwenden. Es kann auch für die photophysikalische Abschätzung der Lichtdosis und die Messung thermischer Einflüsse angepasst werden. Auch hier ist es durch die Verwendung von Modellgeweben möglich, die Lichtexposition zu minimieren, z. B. im Vergleich zur genaueren Bestimmung der Photoschalteffizienz unter den In-vivo-Bedingungen , eine Alternative, die immer interessant sein kann.
Schließlich können die Verbindungen, die in den In-vitro-Toxizitätsscreens überlegene Eigenschaften aufweisen und mindestens 1-1,5 cm tief im Modellgewebe effizient photoschalten, für kostspielige, mühsame und langwierige In-vivo-Studien ausgewählt werden. In diesem Protokoll haben wir die gleiche Zelllinie (LLC) wie in der In-vitro-Bewertung verwendet, um das Allotransplantat-Krebsmodell zu generieren. Die Tumorwachstumsdynamik, die Mortalität und die Anzahl der Metastasen sind die Parameter, die am besten geeignet sind, um die Wirksamkeit gegen Krebs zu beurteilen. Im Vergleich zur konventionellen Chemotherapie wird bei der photopharmakologischen Behandlung ein zusätzlicher Faktor eingesetzt – das Licht. Daher werden zwei Kontrolltiergruppen benötigt: eine, die nur das Fahrzeug erhält, und die andere, die das Fahrzeug und die Bestrahlung erhält. Dieser Aufbau ermöglicht die Bewertung des Einflusses von Licht auf die gemessenen Parameter. In unserem Experiment erhielten die Tiere der beiden Versuchsgruppen die nicht aktivierte Verbindung, und die Tumore der Mäuse in einer Gruppe wurden bestrahlt. Das Bestrahlungsregime war für die Kontroll- und Behandlungsgruppe identisch. Ein Vergleich mit einer Benchmark-Chemotherapie ist zum jetzigen Zeitpunkt nicht erforderlich, da der Hauptzweck des Experiments darin besteht, die kombinierte Wirkung von Licht- und Wirkstoffanwendung zu demonstrieren. Die leistungsstärksten Verbindungen, die diesen Effekt aufweisen, können dann für weitere Studien auf ihre In-vivo-Toxizität und den Vergleich mit Benchmarks ausgewählt werden, um wichtige Entscheidungen über ihre Entwicklung zu treffen. Technisch kann das von uns beschriebene In-vivo-Experiment leicht an pharmakokinetische oder pharmakodynamische Studien angepasst werden, z. B. an einer Verbindung, die bereits als Leitstoff ausgewählt ist.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren würdigen die EU-Finanzierung durch das H2020-MSCA-RISE-Programm durch die Projekte PELICO (#690973) und ALISE (#101007256). Diese Arbeit wurde durch das DFG-GRK 2039 (SA, TS und ASU), das NACIP-Programm der Helmholtz-Gemeinschaft (SA und ASU) und das VIP+ des BMBF (OB und ASU) unterstützt. Wir danken Dr. Serhii Koniev vom Karlsruher Institut für Technologie, der die Verbindung LMB002 synthetisiert, gereinigt und freundlicherweise für die Studie zur Verfügung gestellt hat. Die Autoren danken auch Chupryna Maksym, die das Video in der Ukraine gedreht und zusammengestellt hat, und allen mutigen Verteidigern der Ukraine, die die experimentelle Arbeit, das Schreiben und das Filmen dieser Publikation ermöglicht haben.
Agilent 1100 Series capillary LC system | ALSI-Chrom (Agilent distributor) | – | |
ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Lewis lung carcinoma cell line | ECACC | 90020104 | |
C57BL/6NCrl mice, female, inbred | Charles River | Strain code: 027 | |
CelCulture, CO2 incubator | Esco Micro | CCL-170B | |
Corning Matrigel Basement membrane matrix | Merck | CLS354234 | |
Corning, 384- well spheroid microplates | Merck | CLS3830 | |
Fetal bovine serum | Merck | F7524 | |
Gibco, DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21600044 | |
Gramicidin S | Lumobiotics | Custom synthesis | |
HyClone, DMEM/high glucose | Cytiva | SH30003.04 | |
IN Cell Analyzer 6500HS, imaging system | Cytiva | 29240358 | |
Invitrogen, Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | |
Isoflurane anesthesia machine | ASA | S/N ASA 1305 | |
L-glutamine, 200 mM solution | Merck | G7513 | |
LIKA-surgeon, diode surgery laser | Fotonika plus | – | |
LMB002 | Lumobiotics | Custom synthesis | |
Penicillin–Streptomycin, solution stabilized | Merck | P4333 | |
PhenoPlate, 96-well plates | PerkinElmer | 6055302 | |
Photometer PCE-LED 20 | PCE Instruments | PCE-LED 20 | |
Thermo Scientific, Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
Thermo Scientific, Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | J66764-MC | |
Trypan blue, 0.4% solution | Merck | T8154 | |
Trypsin–EDTA, 10 x solution | Merck | T4174 | |
UltraCruz Cell culture flasks with vented caps, 75 cm2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-200263 | |
UltraCruz, bottle top filters, PES, 0.22 μm | Santa Cruz Biotechnology | sc-360882 | |
Vydac 218TP, C18 HPLC column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm) | Altmann Analytik (Avantor distributor) | GR5103827 |