このプロトコルは、そのような化合物の前臨床スクリーニングに使用できる光切り替え性抗癌ペプチドの評価に採用された一連の実験を提示します。これには、2Dおよび3D細胞培養における細胞毒性評価、 ex vivo(モデル組織)の光異性化効率の評価、および in vivo の有効性が含まれます。
光制御された生物学的に活性な化合物は、「スマート」医薬品候補の新たなクラスです。それらは、良性の非イオン化可能な光を患者の体内の特定の場所に向けることにより、正確な時空間活性化により、全身化学療法の安全性を高めます。この論文では、光制御された生物学的に活性な化合物の光活性化の in vitro 効力と ex vivo効率、および医薬品開発の初期段階でin vivo の有効性を評価するための一連の方法を示します。この方法論は、抗癌細胞傷害性ペプチド、すなわち既知の抗生物質であるグラミシジンSのジアリールエテン含有類似体に適用される。実験は、免疫適格マウスにおける癌細胞株(ルイス肺癌、LLC)、生きた組織代理(豚肉ミンチ)、および同種移植癌モデル(皮下LLC)の2D(接着細胞)および3D(スフェロイド)細胞培養を使用して実行されます。最も効果的な化合物の選択と現実的な光線治療ウィンドウの推定は、自動蛍光顕微鏡によって行われます。さまざまな照明レジメンでの光活性化効率は、モデル組織のさまざまな深さで決定され、最適な光線量が最終的な治療 的in vivo 実験に適用されます。
光制御された生物学的に活性な化合物は、ヒト疾患に対する安全な化学療法の有望な成分として、また悪性固形腫瘍を特異的に根絶するために、ここ数十年で登場しました1。これらの化合物は可逆的に光異性化可能なフラグメント(分子光スイッチ)を含み、異なる波長の光を照射すると不活性な光異性体と活性な光異性体を切り替えることができます。
光制御性のない類似体と比較して、光制御薬は、活性が低く本質的に毒性のない形で患者の体内に全身的に導入でき、腫瘍、潰瘍、創傷などの必要な場合にのみ光によって活性化されるため、より安全である可能性があります。このような分子医薬品のプロトタイプの複数のエキサイティングなデモンストレーションは、最近の学術論文2,3,4,5,6,7で見つけることができますが、承認された薬/医療機器/疾患の組み合わせの応用である臨床光薬理学の分野は存在しません。光薬理学はまだ創薬段階にあり、体系的な前臨床試験は不明です。
ごく最近になって、いくつかの光制御抗癌ペプチド、すなわちペプチド抗生物質グラミシジンS8の類似体に対するin vivoの安全性の利点を実証しました。これらの光制御誘導体は、ジアリールエテン(DAE)光スイッチを含み、いわゆる赤色光生成「開環」光線とUV生成「閉環」光線の間で可逆的な光誘起変換を受ける(誘導体の1つである化合物LMB002について図示)。
図1:光制御細胞傷害性ペプチドLMB002とその光異性化。 ジアリールエテンフラグメントを赤色で示す。略称:DAE =ジアリールエテン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ヒットを見つけ、ヒットtoリード最適化を実行するには、多くの場合、適切な化合物ライブラリのin vitroおよびin vivoスクリーニングが必要です9,10。ここでは、光制御化合物の細胞毒性の体系的なハイスループットスクリーニングに適した方法論を示します。また、光異性化効率を決定し、モデル組織における光線量を推定し、最もパフォーマンスの高い候補のin vivo有効性を評価します。このアプローチは、生命倫理と動物飼育の考慮事項に準拠しています。
この研究では、試験された化合物の制御されていない光異性化を回避するために、従来の前臨床方法が変更されています。本明細書においてこれらの改変方法を適用する全体的な目標は、in vitro 活性を確実に比較し、リード同定およびさらなる開発のための光切り替え可能な化合物の in vivo 有効性試験を合理化するための、簡単で迅速で統計的に有意なデータを生成する一般的な戦略を開発することである。
この戦略は、3つの連続したステップで構成されています。最初のステップでは、2次元(2D、単層)および3次元(3D、スフェロイド)細胞培養および共焦点ハイスループット自動蛍光顕微鏡を使用して、選択した光制御生物学的に活性な化合物の活性および不活性光形態の段階希釈液中のIC50 (見かけの50%細胞生存率)を測定します。光線療法ウィンドウは、2つの光形態間のIC50 差に関して比較され、最も性能の高い候補が選択される。自動顕微鏡検査やその他の細胞毒性スクリーニングプラットフォーム(アッセイ)による毒性評価には特別な利点はありません11。より複雑な細胞ベースの腫瘍モデル12 は、この段階で容易に実施することができる。
ステップ1で選択した化合物について、第2ステップは、照射されたサンプル抽出物のUV検出高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用して、組織サロゲート中の活性の低い光形態の光スイッチング効率を定量することにより、照射された組織表面からの深さの関数として組織内の光スイッチング効率を現実的に推定することです。 in vivoでは 、光スイッチング効率を研究することができますが、単純な組織代理である豚ひき肉を使用することを提案します。このアプローチの妥当性をテストしました。マウスのがんモデルで in vivo での光スイッチ性化合物の変換を測定し、マウス8を用いた以前の実験で測定された深さでほぼ同じ光変換を観察しました。任意の適切な代替人工組織13、3Dバイオプリント組織/器官14、生検材料、または別の免除動物材料を使用することができる。ただし、この設定は経済的、高速、倫理的であるため、適切な妥協案です。
第3のステップは、マウス癌モデルにおける in vivo 抗癌有効性の決定である。 in vitro 実験で優れた特性を示し、モデル組織で少なくとも1〜1.5cmの深さで効率的に光スイッチングを示す化合物をこの実験用に選択します。
このプロトコルは、それらの光形態(またはそれらの光定常状態、PSS)が妥当な時間(数日以上)安定していれば、異なるタイプの光スイッチを有する化合物に適用することができる。説明のために、前述のDAE由来のLMB002が15使用される。LMB002フォトフォームは熱的に安定しており、実質的な劣化なしに少なくとも1年間-20°Cで保存できます。ルイス肺癌(LLC)細胞は、このイン ビトロ および インビボ のデモンストレーションのために選択されますが、細胞の種類に制限はありません。LLC細胞は接着性であり、3Dで容易に培養可能であり、そして腫瘍様を生成するために使用される(参考文献16に記載されているように)。 生体内 LLC細胞は転移過程をモデル化するために使用され、皮下注射後に免疫適格マウスにおいて固形腫瘍を容易に生成することができる。この in vivo 方法論は、他の癌モデルに普遍的に適用することができる17、18。この戦略の詳細な実装については、以下で説明します。
光制御化合物は、医薬品開発において前例のないものです。しかし、それらの前臨床的および臨床的評価のための方法は確立されていない。最も近い単剤療法アナログである光線力学療法(PDT)は、癌に対して多くの国で採用されている臨床使用の治療法であり、他の適応症のために開発中です19,20。光薬理学と同様に、PDTも光を使用して生理活性物質(一重項酸素)を活性化することに基づいています。したがって、PDTの前臨床試験および臨床試験に使用されるいくつかの実験方法を光薬理学に採用することができます。たとえば、光源、光配信アプローチ、および医療機器は十分に開発され、PDT用に承認されています。それらは光制御薬物の評価に直接使用することができます。ただし、PDTと光薬理学には互いに多くの違いがあり4、後者の特定の方法を確立する必要性を正当化します。
第一に、PDT(酸素)中の非活性化物質は、非毒性濃度で生体組織中に常に存在する。対照的に、活性化されていない光制御生物学的活性化合物は、残存活性および望ましくない毒性を有し得る。したがって、理想的な光薬理学的薬物は、投与された形態では生物学的活性を最小限に抑え、光生成形態で非常に活性が高くなければならず、「光線療法ウィンドウ」21 は可能な限り大きくなければなりません。ヒットを見つけてヒットtoリード最適化を実行するには、すでに医薬品開発の初期段階にある、適切な化合物の同定と比較的大規模なライブラリのスクリーニングが必要です。ここでは、効率的な光スイッチング化合物を同定するための自動ハイスループット共焦点蛍光顕微鏡法を提案しました。
選択された細胞毒性評価方法は、最も重要な要件 – PSSの維持または可視光感受性光異性体の安定性 – を容易に実施することを可能にする。これは、その実装時に、光の露出が最小限に抑えられるためです。したがって、別の方法を選択する場合は、自動化された方法をお勧めします。このアプローチは信頼性が高く有益です。この段階で3D細胞培養(スフェロイド)を使用することで、より現実的な組織様微小環境での治療に対する細胞の反応を全体的に理解することができます。さらに、化合物の作用機構に関する貴重な洞察は、直接法として顕微鏡法を使用して得ることができます。適切な染色プロトコルを備えた共焦点蛍光顕微鏡法により、細胞とスフェロイドの形態を視覚的に評価できます。細胞死や細胞内の変化に関する重要な詳細も検出できます。
第二に、軽い適用は軽い投与量の慎重な選択を必要とします。PDTでは、軽い過剰摂取は組織に非常に有害です22。光薬理学的療法は、過度の光照射下で有利であり得る。活性化物質の上限は、非活性化物質の投与量およびその薬物動態によって規定される。しかし、光線量は依然として光薬理学における問題です。照射力密度と露光時間が治療 の要件以上である ことを確認するように注意する必要があります。原則として、活性化物質の生成は インビボでモニターすることができる。しかし、生命倫理上の理由から、我々はモデル組織(新鮮なひき肉)に非活性化化合物15を混合した実験を提案した。この実験は簡単で、さまざまな光源を使用するように変更できます。また、光線量の光物理学的推定や熱影響の測定にも適応できます。ここでもまた、モデル組織を用いることによって、光曝露を最小化することが可能であり、例えば、 インビボ 条件におけるより正確な光スイッチング効率決定と比較して、常に検討することが興味深いかもしれない代替案である。
最後に、in vitro 毒性スクリーニングにおいて優れた特性を示し、モデル組織において少なくとも1〜1.5cmの深さで効率的に光スイッチングする化合物は、費用がかかり、手間がかかり、時間のかかる in vivo 研究のために選択することができる。このプロトコルでは、 in vitro 評価と同じ細胞株(LLC)を使用して、同種移植がんモデルを作成しました。腫瘍増殖動態、死亡率、および転移数は、抗がん効果の評価に最も適したパラメータです。従来の化学療法と比較して、追加の要因が光薬理学的治療に適用されます – 光。したがって、2つの対照動物群、すなわち、ビヒクルのみを受け取る動物群と、ビヒクルおよび照射を受ける動物群の2つが必要である。このセットアップにより、測定パラメータに対する光の影響を評価できます。本発明者らの実験では、2つの実験群の動物に非活性化化合物を投与し、一方の群のマウスの腫瘍に放射線を照射した。照射レジームは、対照群と治療群で同一でした。実験の主な目的は、光と化合物の適用の複合効果を実証することであるため、ベンチマーク化学療法との比較はこの段階では必要ありません。次に、この効果を示す最も優れた化合物を選択して、 in vivo 毒性に関するさらなる研究と、それらの開発に関する重要な決定を下すためのベンチマークとの比較を行うことができます。技術的には、我々が説明する インビボ 実験は、例えば、薬物リードとしてすでに選択されている化合物の薬物動態学的または薬力学学的研究に容易に適合させることができる。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、ペリコ(#690973)およびALISE(#101007256)プロジェクトを通じたH2020-MSCA-RISEプログラムによるEUの資金提供を認めている。この研究は、DFG-GRK 2039(SA、TS、ASU)、ヘルムホルツ協会のNACIPプログラム(SAおよびASU)、およびBMBFのVIP+(OBおよびASU)によってサポートされました。化合物LMB002を合成し、精製し、研究のために化合物を提供してくださったカールスルーエ工科大学のSerhii Koniev博士に感謝します。著者はまた、ウクライナでビデオを撮影および編集したChupryna Maksymと、この出版物の実験的な作業、執筆、撮影を可能にしたウクライナのすべての勇敢な擁護者に感謝しています。
Agilent 1100 Series capillary LC system | ALSI-Chrom (Agilent distributor) | – | |
ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Lewis lung carcinoma cell line | ECACC | 90020104 | |
C57BL/6NCrl mice, female, inbred | Charles River | Strain code: 027 | |
CelCulture, CO2 incubator | Esco Micro | CCL-170B | |
Corning Matrigel Basement membrane matrix | Merck | CLS354234 | |
Corning, 384- well spheroid microplates | Merck | CLS3830 | |
Fetal bovine serum | Merck | F7524 | |
Gibco, DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21600044 | |
Gramicidin S | Lumobiotics | Custom synthesis | |
HyClone, DMEM/high glucose | Cytiva | SH30003.04 | |
IN Cell Analyzer 6500HS, imaging system | Cytiva | 29240358 | |
Invitrogen, Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | |
Isoflurane anesthesia machine | ASA | S/N ASA 1305 | |
L-glutamine, 200 mM solution | Merck | G7513 | |
LIKA-surgeon, diode surgery laser | Fotonika plus | – | |
LMB002 | Lumobiotics | Custom synthesis | |
Penicillin–Streptomycin, solution stabilized | Merck | P4333 | |
PhenoPlate, 96-well plates | PerkinElmer | 6055302 | |
Photometer PCE-LED 20 | PCE Instruments | PCE-LED 20 | |
Thermo Scientific, Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
Thermo Scientific, Propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | J66764-MC | |
Trypan blue, 0.4% solution | Merck | T8154 | |
Trypsin–EDTA, 10 x solution | Merck | T4174 | |
UltraCruz Cell culture flasks with vented caps, 75 cm2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-200263 | |
UltraCruz, bottle top filters, PES, 0.22 μm | Santa Cruz Biotechnology | sc-360882 | |
Vydac 218TP, C18 HPLC column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm) | Altmann Analytik (Avantor distributor) | GR5103827 |