Рыбки данио-рерио, нацеленные на реактивные электрофилы и окислители (Z-REX), представляют собой основанный на химической биологии метод исследования реактивной низкомолекулярной сигнализации. Эта техника может быть применена к живым рыбам разных стадий развития. Здесь мы объединяем стандартные анализы рыбок данио-рерио с Z-REX для анализа сигнального пути.
Реактивные метаболиты и связанные с ними электрофильные препараты являются одними из самых сложных малых молекул для изучения. Традиционные подходы к деконструкции механизма действия (MOA) таких молекул используют объемную обработку экспериментальных образцов с избытком определенного реакционноспособного вида. В этом подходе высокая реакционная способность электрофилов делает неизбирательную маркировку протеома в зависимости от времени и контекста; Окислительно-восстановительные белки и процессы также могут быть косвенно и часто необратимо затронуты. На таком фоне бесчисленных потенциальных целей и косвенных вторичных эффектов увязка фенотипа с конкретным целевым взаимодействием остается сложной задачей. Рыбки данио-рерио, нацеленные на реактивные электрофилы и окислители (Z-REX) – платформа доставки реактивного электрофила по требованию, адаптированная для использования у личинок рыбок данио, – предназначена для доставки электрофилов к определенному интересующему белку (POI) в невозмутимых эмбрионах живых рыб. Ключевые особенности этого метода включают низкий уровень инвазивности, а также прецизионную электрофильную доставку с дозировкой, хемотипом и пространственно-временным контролем. Таким образом, в сочетании с уникальным набором контрольных элементов этот метод позволяет избежать нецелевых эффектов и системной токсичности, которые в противном случае наблюдаются после неконтролируемого массового воздействия на животных реактивных электрофилов и плейотропных электрофильных препаратов. Используя Z-REX, исследователи могут закрепиться в понимании того, как изменяются индивидуальные реакции на стресс и сигнальные выходы в результате специфического взаимодействия реактивного лиганда с конкретным POI в почти физиологических условиях у интактных живых животных.
Мириады клеточных сигнальных событий включают реакции между небольшими реакционноспособными молекулами (эндогенно продуцируемыми в клетке или ксенобиотиками / ксенометаболитами, такими как лекарства) и их белковой мишенью. Во многих случаях субстехиометрический уровень таких ковалентных событий связывания может вызывать клеточные реакции, приводящие к изменениям, например, в развитии, метаболизме, апоптозе и/или иммунном ответе1. Однако деконструкция механизма действия (MOA) путем связывания конкретных событий связывания с их фенотипическими последствиями оказалась сложной задачей. Традиционные методы болюсного дозирования, которые включают введение высоких концентраций реакционноспособных веществ, часто приводят к модификации множества белков, а также к чрезмерной токсичности для модельного организма2. Такие условия далеки от идеала. Был разработан метод решения этих проблем в культуре клеток с использованием прецизионной локализованной доставки электрофилов в нативном клеточном контексте, названный T-REX (целевые реактивные электрофилы и окислители)3. В последующие годы основное внимание было уделено экспериментам на целых организмах, которые дают возможность изучать белки в определенных клеточных контекстах в нетрансформированных клетках. Таким образом, мы расширили технику, чтобы она была совместима с несколькими моделями, включая модели эмбрионов Danio rerio . Здесь мы представляем Z-REX (рыбки данио, нацеленные на реактивные электрофилы и окислители) (рис. 1).
Чтобы понять Z-REX, в этой статье сначала представлены технологии REX и лежащие в их основе концепции. По своей сути эти методы моделируют передачу сигналов эндогенных физиологических реактивных электрофильных частиц (RES), имитируя то, как природные электрофилы локально производятся in vivo с пространственно-временной точностью. Интересующий белок (POI) экспрессируется как слитая конструкция с Halo; последний закрепляет тканепроницаемый и инертный зонд, несущий РЭС в фотоклетке, в стехиометрии 1:1. Одним из таких эндогенных РЭС является 4-гидроксиноненаль (далее HNE), который фотоклетка в зонде Ht-PreHNE. Во многих случаях мы используем алкин-функционализированную версию HNE [т.е. HNE (алкин)], которая имеет по существу идентичные биологические свойства HNE, но может быть помечена клик-химией. Зонд, который также функционализирован хлоралканом для реакционной способности с Halo, называется Ht-PreHNE (алкин). Комплекс слияния Halo-POI и образованный таким образом зонд позволяют проксимально доставлять ВИЭ к расплавленному ПОИ при облучении ультрафиолетовым светом. Если POI быстро реагирует с высвобожденным RES, результирующая ковалентная маркировка POI с RES позволяет нам идентифицировать кинетически привилегированные цистеины.
Z-REX использует вышеупомянутые преимущества технологий REX и широко применяет их для изучения конкретных сигнальных путей у живой рыбы. Этот протокол был оптимизирован для рыбок данио-рерио (D. rerio), поскольку они являются генетически обрабатываемыми позвоночными организмами, которые прозрачны во время развития и, таким образом, идеально подходят для оптико-химических/генетических методов, таких как технологии REX. Тем не менее, аналогичная стратегия, вероятно, также будет хорошо работать на других генетически поддающихся лечению видах рыб, поскольку широкая применимость метода обусловлена псевдовнутримолекулярным механизмом доставки липидного электрофила (LDE). Действительно, процедура является высоко биосовместимой, поскольку рыбу можно обрабатывать фото-электрофилом Z-REX [например, Ht-PreHNE (алкин)] в течение не менее 48 часов без какого-либо заметного воздействия на развитие. Аналогичный протокол функционирует у C. elegans 4,5.
В протоколе впервые описывается использование инъекции мРНК для получения временной экспрессии ненативной конструкции слияния Halo-POI в эмбриональных моделях рыбок данио-рерио через 1-1,5 дня после оплодотворения (dpf). Это приводит к экспрессии эктопического белка в большинстве клеток рыбы (далее именуемых «вездесущими»), а не в определенных тканях или местах; Однако данные показывают, что в некоторых случаях могут наблюдаться клеточные эффекты. После инъекции эмбрионы инкубируют с низкой концентрацией [0,3-5 мкМ Ht-PreHNE (алкин)] зонда в течение 30,5 ч после оплодотворения (HPF). Затем, в заданное пользователем время, доставка ВИЭ в POI внутри рыбы достигается путем фотодемонтажа в течение 2-5 минут. После фотодемонтажа ВИЭ в течение следующих 2-10 часов могут быть выполнены различные последующие фенотипические анализы: 1) живое изображение репортерных линий (рис. 2А); 2) оценка маркировки мишеней методом вестерн-блоттинга (рис. 3); 3) транскриптомный анализ (рис. 4); или 4) иммунофлюоресценция всего массива (рис. 5).
В качестве примера живого изображения репортерных линий Z-REX демонстрируется в тандеме с живым изображением рыбных линий, Tg (lyz: TagRFP) и Tg (mpeg1: eGFP), чтобы измерить, как модификация RES конкретного электрофильного сенсора POI (а именно Keap1) снижает уровни нейтрофилов и макрофагов соответственно без наблюдаемого воздействия на другие клетки рыбы. Однако ранее мы показали, что POI-маркировка и последовательный путь передачи сигналов из исследований T-REX могут быть воспроизведены с использованием Z-REX для нескольких белков: Akt3 6, Keap17 и Ube2v26. В целом, с помощью Z-REX ученые могут изучать последствия ковалентной модификации POI с помощью ВИЭ в контексте нескольких сложных окислительно-восстановительных путей. Этот метод предназначен для точного определения мишеней и их функциональных остатков для дизайна ковалентного лекарственного средства и новых лекарственных механизмов в более контекстуально релевантной модели целого животного.
Z-REX, описанный в этом протоколе, демонстрирует надежную стратегию исследования пары электрофил-мишень и деконволюции сигнального пути у живой рыбы. Близкая доставка позволяет дозировать и пространственно контролировать обработку электрофильным соединением. В отличие от обычных методов болюсного дозирования, в которых супрафизиологические концентрации развернутого электрофила часто приводят к нецелевым проблемам, относительно небольшое количество электрофила, высвобождаемого в систему, делает Z-REX в значительной степени неинвазивным. Мы использовали 0,1-6 мкМ Ht-PreHNE (алкин) в эмбрионах рыбок данио, и результаты показали, что лечение не наносит вреда развитию эмбриона11.
Процедура Z-REX, как правило, длиннее, чем T-REX, метод скрининга / изучения электрофильных чувствительных белков в культивируемых клетках. Предположим, что целью эксперимента является скрининг взаимодействия электрофила с мишенью; мы предлагаем сначала провести обширный скрининг T-REX в культивируемых клетках и использовать Z-REX для проверки in vivo и фенотипического анализа / анализа путей. По сравнению с клеточными культурами, требования для выполнения Z-REX являются базовыми методами рыбоводства в дополнение к биохимическим экспериментальным навыкам, требуемым T-REX. Типичные временные рамки для Z-REX (от скрещивания рыбы до светоиндуцируемой электрофильной доставки) составляют 2-3 дня, что не более чем на 1 день больше, чем типичное время для эксперимента T-REX на трансфицированных живых клетках. Живая визуализация для фенотипического анализа может быть выполнена через 2-10 ч после светового освещения; Клик-соединение с биотин-азидом для анализа вытягивания занимает 3 дня; qRT-PCR для анализа транскрипционного ответа занимает 3 дня; Окрашивание IF занимает 5 дней. Эти этапы примерно аналогичны их эквивалентам в клеточных культурах, хотя интерпретация данных требует понимания физиологии рыб и репортерных штаммов.
В качестве процедуры12 с несколькими переменными для Z-REX необходимо несколько контрольных групп, чтобы исключить неопределенности в результатах (рис. 1D). Общими контрольными группами являются: (1) только обработка ДМСО/транспортного средства; (2) обработка зонда, но без светового освещения; (3) световое освещение, но без зондовой обработки; (4) P2A-сплит-конструкция, в которой Halo и POI выражаются отдельно, поэтому доставка близости удаляется; и (5) гипоморфные мутанты, чьи электрофильные остатки мутируют, такие как Akt3 (C119S)6 и Keap1 (C151S, C273W, C288E)5, которые мы использовали в предыдущих исследованиях.
Если последующие анализы включают анализ вестерн-блоттинга, перед сбором урожая необходимо провести дейолтинг. Белки желтка снижают точность оценок концентрации лизата и могут неспецифически связываться с антителами. При визуализации живой рыбы или окрашивании IF целиком мы также наблюдали неспецифические флуоресцентные сигналы в желточном мешке, вероятно, возникающие в результате аутофлуоресцентных белков в желточном мешке или неспецифического связывания самих антител. Если сигнал автофлуоресценции мешает сигналу, мы предлагаем исключить желточный мешок из количественного определения или количественно определить разные области отдельно. Дехоринация необходима для визуализации живой рыбы и анализа окрашивания IF целиком. Хорион может мешать визуализации, а затем и количественной оценке/подсчету клеток. Однако дехоринация применима только к эмбрионам старше 1 DPF; Более молодые эмбрионы на стадиях бластуляции/гаструляции/сегментации слишком хрупкие, чтобы их можно было дехорионировать.
Описанный здесь протокол Z-REX основан на экспрессии эктопических POI, управляемой мРНК. Процедура является быстрой по сравнению с использованием/созданием трансгенных рыбных линий. Экспрессия, управляемая мРНК, является повсеместной и преходящей и длится не менее 2 дней для мРНК, используемых в этом протоколе. Однако продолжительность экспрессии, вероятно, будет варьироваться в других случаях. Таким образом, этот подход обеспечивает быстрое и более глобальное окно исследования эффектов конкретного события электрофильной маркировки, совместимое с несколькими анализами с высокой пропускной способностью / высоким содержанием. Трансгенные линии со стабильной экспрессией Halo-POI в определенных тканях также совместимы с Z-REX11. Такие линии лучше всего использовать, когда необходимо задать более точный вопрос, например, когда фенотип в конкретном органе предсказывается на основе данных клеточных культур или когда скрининг из экспериментов по инъекции мРНК предсказывает, что конкретный орган чувствителен к событию электрофильной маркировки. Индукция антиоксидантного ответа, специфичная для сердца, через Z-REX была продемонстрирована с использованием рыбы Tg (gstp1: GFP; DsRed-P2A-myl7: Halo-TeV-Keap1) в нашей предыдущей публикации11. Также может быть возможно выполнить Z-REX на трансгенных рыбах старше 2 dpf.
The authors have nothing to disclose.
Финансирование: Novartis FreeNovation, NCCR и EPFL.
2-Mercaptoethanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
10-cm Petri dishes | Celltreat | 229692 | |
2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-C-S | |
30% Acrylamide and bis-acrylamide solution | BioRad | 1610154 | |
6-well plate | Celltreat | 229506 | |
Acetone | Fisher | A/0600/15 | |
Agarose | GoldBio | A201-100 | |
All Blue Prestained Protein Standards | BioRad | 1610373 | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
Biotin-dPEG11-azide | Quanta Biodesign | 102856-142 | |
Bradford Dye | BioRad | 5000205 | |
BSA | Fisher | BP1600-100 | |
Capillary tubes | VWR | HARV30-00200 | |
Chloroform | Supelco, Inc | 1.02445.1000 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
Cu(TBTA) | Lumiprobe | 21050 | |
CuSO4 | Sigma | 209198 | |
DMSO | Fisher | D128-500 | |
Donkey anti-mouse-Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150107 | 1:800 (IF) |
Donkey anti-rabbit-Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150075 | 1:1000 (IF) |
Donkey anti-rat-AlexaFluor 568 | Abcam | ab175475 | 1:1000 (IF) |
ECL substrate | Thermo Fisher Scientific | 32106 | |
ECL-Plus substrate | Thermo Fisher Scientific | 32132 | |
End-to-end rotator | FinePCR | Rotator AG | |
Ethanol | Fisher | E/0650DF/15 | |
Ethidium bromide | Sigma | E1510 | |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
Fluorescence stereomicroscope | Leica | M165 FC | |
Forceps (blunt) | self made | self made by blunting sharp forceps (Fine Science Tools, Dumont #5, 11252-40) | |
Forceps (sharp) | Fine Science Tools | Dumont #5, 11252-40 | |
Gel loading tip | Fisher | 02-707-181 | |
Gel/blot imager | Vilber | Fusion FX imager | |
Glass beads | Sigma | 45-G1145 | |
Glass stage micrometer | Meiji Techno. | MA285 | |
Heat inactivated FBS | Sigma | F2442 | |
Heated ultrasonic bath | VWR | 89375-470 | |
HEPES | Fisher | BP310-1 | |
High capacity streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20359 | |
Ht-PreHNE alkyne probe | self-made | – | Parvez, S. et al. T-REX on-demand redox targeting in live cells. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016). |
Imaging plate (10% HBSS buffer, for live embryos) | Made with Petri dish, and 2% agarose in 10% HBSS buffer | ||
Imaging plate (PBS, for formaldehyde-fixed embryos) | Made with Petri dish, and 2% agarose in PBS | ||
Injection plate | Made with microinjection mold, Petri dish, and 2% agarose in 10% HBSS buffer | ||
LDS | Apollo | APOBI3331 | |
Methanol | VWR | 20864.32 | |
Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | |
Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
Microscope for micro-injection | Olympus | SZ61 | |
Microscope light source | Olympus | KL 1600 LED | |
Mineral oil | Sigma | M3516 | |
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
Mouse anti- β-actin-HRP | Sigma | A3854 | 1:20000 (WB) |
Mouse anti-HaloTag | Promega | G921A | 1:500 (IF) |
Multi-mode reader | BioTek Instruments | Cytation 5 | |
Nucleic acid agarose gel electrophoresis apparatus | Biorad | Mini-Sub Cell GT Systems | |
Oligo(dT)20 | Integrated DNA Technologies | customized: (dT)20 | |
Orange G | Sigma | O3756 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
PBS | Gibco | 14190144 | |
pCS2+8 Halo-2XHA-P2A-TeV-Keap1-2xHA | self-cloned | – | Available from Prof. Yimon AYE's group at EPFL |
pCS2+8 Halo-TeV-Keap1-2xHA | self-cloned | – | Available from Prof. Yimon AYE's group at EPFL |
Pneumatic PicoPump | WPI | SYS-PV820 | |
Protein electrophoresis equipment and supplies | Biorad | Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis | |
Rabbit anti-active Caspase-3 | BD Pharmingen | 559565 | 1:800 (IF) |
Rat anti-HA-HRP | Sigma | H3663 | 1:500 (IF and WB) |
Rat anti-RFP | ChromoTek | 5F8 | 1:800 (IF) |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
RNAseOUT recombinant ribonuclease inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
RnaseZap RNA decontamination solution | ThermoFisher Scientific | AM9780 | |
Rocking Shaker | DLAB | SK-R1807-S | |
SDS | Teknova | S9974 | |
SuperScript III reverse transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080085 | |
t-Butanol | Sigma | 471712 | |
TCEP-HCl | Gold Biotechnology | TCEP1 | |
TeV protease (S219V) | self-made | – | Parvez, S. et al. T-REX on-demand redox targeting in live cells. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016). |
Tg(lyz:TagRFP) | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | uwm11Tg (ZFIN) | – |
Tg(mpeg1:eGFP) | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | gl22Tg (ZFIN) | – |
Thermal cycler | Analytik Jana | 846-x-070-280 | |
TMEDA | Sigma | T7024 | |
Transfer pipets | Fisher | 13-711-9D | |
Tris | Apollo | APOBI2888 | |
Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
TRIzol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma | T9003 | |
Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
UV lamp with 365-nm light | Spectroline | ENF 240C | |
UV meter | Spectroline | XS-365 | |
Vortexer | Scientific Industries, Inc. | Vortex-Genie 2 | |
Western Blotting Transfer equipment and supplies | Biorad | Mini Trans-Blot or Criterion Blotter | |
Zebrafish husbandry and breeding equipment | in house | ||
Zirconia beads | BioSpec | 11079107zx |