Monitoramento de respostas de sinalização no alvo em larvas de peixe-zebra - Z-REX desmascara mecanismos precisos de drogas eletrofílicas e metabólitos

Os procedimentos de criação e manejo de zebrafish na Universidade de Cornell (Estados Unidos) foram realizados seguindo as diretrizes do National Institutes of Health (NIH) e aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Os procedimentos de criação e manejo de peixes-zebra na unidade de peixe-zebra do Instituto Federal Suíço de Tecnologia de Lausanne (EPFL, Suíça) foram realizados seguindo a Lei de Bem-Estar Animal SR 455 e a Portaria de Bem-Estar Animal SR 455.1, com autorização veterinária cantonal VD-H23. NOTA: Neste protocolo, as linhas de peixes Tg( lyz:TagRFP ) e Tg(mpeg1:EGFP) expressando Halo-TeV-Keap1 são usadas para demonstrar Z-REX. O método pode ser estendido a outras proteínas de interesse, linhagens de peixes repórteres transgênicos e ensaios biológicos a jusante. Consulte a Tabela Suplementar 1 para os buffers utilizados neste estudo. Todos os reagentes, instrumentos, equipamentos, anticorpos, plasmídeos, cepas de peixe-zebra e equipamentos estão listados na Tabela de Materiais. 1. Preparação de mRNA Preparar o mRNA Halo-TeV-Keap1-2xHA e Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA usando o kit de transcrição in vitro mMessage mMachine SP6.NOTA: Siga as instruções do fabricante e execute reações em escala de 40 μL para cada mRNA. Redissolver a pastilha de RNAm em 10 μL de água livre de nucleases. Avaliar a qualidade do RNAm e medir a concentração por espectrofotômetro de microvolume e eletroforese em gel de agarose. Um mRNA de boa qualidade deve ter uma relação A260/A280 em torno ou acima de 2,0. Diluir o mRNA para 1-1,5 mg/mL com água livre de nucleases. Aliquot a solução de mRNA (1-2 μL por tubo) e armazenar as alíquotas a -80 °C. 2. Produção de embriões de peixe Opção 1: Produção de embriões de peixes selvagens (WT).Configure 10 pares de cruzamento de peixes em 10 tanques separados, com cada tanque contendo um divisor entre os peixes machos e fêmeas.NOTA: Um total de 10 pares cruzados normalmente fornece um número suficiente de embriões para os ensaios. O número de pares de cruzamentos pode ser ajustado de acordo com o desenho/necessidade do experimento e a fecundidade do peixe progenitor. Na manhã seguinte, após a instalação do injetor, retire as divisórias em cinco dos tanques. Aguarde 30 min para o peixe acasalar. Mova os peixes-mãe para outro tanque, colete embriões passando a água do tanque através de um filtro e, em seguida, enxágue os embriões do filtro em uma placa de Petri de 10 cm. Esses embriões serão usados para a primeira rodada de injeções.NOTA: Se a qualidade do ovo de um determinado lote for ruim (por exemplo, os ovos são opacos devido à agregação de proteínas), não os agrupe com os outros embriões. (Opcional) Efectuar procedimentos semelhantes aos descritos nos passos 2.1.2-2.1.3 nos outros cinco tanques para a próxima injecção.NOTA: É melhor realizar apenas uma rodada de injeção, para minimizar a diferença de idade entre os embriões. No entanto, se forem necessários mais embriões do que podem ser injetados em um lote, recomenda-se a realização de duas rodadas de injeção para garantir que os embriões permaneçam em um estágio de 1-4 células durante a injeção de mRNA. O número de tiros de injeção pode ser ajustado de acordo com a habilidade de injeção do operador e o design do experimento. No entanto, sugere-se realizar todo o procedimento (desde a remoção do primeiro divisor até a injeção do último embrião) dentro de 2 h. Uma grande diferença de idade entre os embriões pode prejudicar a confiabilidade e a reprodutibilidade dos resultados do experimento. Opção 2: Produção de embriões de peixe repórter neutrófilos/macrófagos heterozigotos transgênicos.Configure 10 pares de cruzamento de peixes em 10 tanques separados, com cada tanque inserido com um divisor entre peixes pais machos e fêmeas: peixes WT versus Tg( lyz:TagRFP) ou peixes WT versus Tg(mpeg1:eGFP).NOTA: Evite cruzamentos entre peixes transgênicos heterozigotos, que podem afetar as leituras fluorescentes a jusante, pois os peixes repórteres homozigotos mostram um sinal fluorescente mais alto em comparação com os peixes heterozigotos. Linhas de repórteres transgênicos e embriões WT podem ser facilmente distinguidos durante a obtenção de imagens. Ter uma mistura de WT e embriões heterozigotos no mesmo pool não é um problema. lyz:TagRFP relata neutrófilos, e mpeg:eGFP relata macrófagos. Esse protocolo também pode ser aplicado a outras linhas de peixes. Siga as etapas 2.1.2-2.1.4. 3. Configuração do microinjetor Ligue a fonte de ar, ajuste a contrapressão para 0,2-0,5 psi e ajuste a pressão de injeção para 25-30 psi. A faixa de pressão específica mostrada é normalmente recomendada.NOTA: É essencial ter uma contrapressão estável para evitar o refluxo do meio de peixe para a agulha. Ao calibrar o volume de injeção na etapa 3.8, apenas o tempo de injeção deve ser alterado. Não altere a pressão de injeção nos seguintes passos; A baixa pressão de injeção pode levar à falha da injeção devido à tensão superficial e interfacial, enquanto a alta pressão de injeção pode danificar os embriões. Limpe o equipamento e a plataforma de injeção com solução de descontaminação RNase.NOTA: A RNase, que degrada o mRNA, pode vir do operador ou do equipamento. É necessário realizar a limpeza antes do experimento, e usar luvas. (Opcional) Se co-injetar mRNA e morfolino, premix os dois em um tubo de 0,2 mL.NOTA: Z-REX funciona bem usando solução de mRNA Halo-TeV-Keap1-2xHA com uma concentração de 250-1500 ng/μL. Vários morfolínos também têm sido utilizados em zebrafish, e as concentrações ótimas têm sido relatadas7. Se estiver usando um morfolino com uma sequência não publicada, o operador deve primeiro avaliar a toxicidade e a eficiência de knockdown do gene do morpholino antes de usá-lo em Z-REX. Transfira 1-2 μL de mRNA (e/ou morfolino, quando aplicável7) para uma agulha de injeção com uma ponta de pipeta de microcarregador.NOTA: Se preparar agulhas com um puxador de micropipeta Flaming/Brown, a configuração é a seguinte. Calor: 520 unidades; força de tração: 60 unidades; velocidade: 70 unidades; atraso: 155 unidades; pressão: 550 unidades; rampa: 530 unidades. Instale a agulha no manipulador de microinjeção.NOTA: A contrapressão da fonte de ar deve empurrar a solução de mRNA(/morpholino) para a ponta da agulha. Use pinças afiadas ou uma lâmina de barbear para quebrar a ponta da agulha, criando uma abertura adequada para injeção. Submergir a ponta da agulha em óleo mineral em um micrômetro de estágio. Aplique dois ou três pulsos de injeção para remover bolhas de ar na ponta. Calibre o tamanho da gota para 2 nL alterando o tempo de injeção.NOTA: Isso é melhor realizado injetando em óleo mineral (que imita a viscosidade do saco vitelino) colocado sobre um hemocitômetro. Usando um microscópio, use as linhas de grade do hemocitômetro para estimar o tamanho da gotícula formada durante a injeção e ajustar o tempo de injeção de acordo. Embora o corante vermelho de fenol às vezes seja usado, a necessidade dele no procedimento de injeção de RNAm descrito aqui não foi observada. 4. Microinjeção Encha uma placa de injeção com meio fresco de solução salina balanceada de Hank a 10% (HBSS) e alinhe os embriões nos sulcos da placa com pinças rombas.NOTA: A placa de injeção é preparada com agarose a 2% em meio HBSS a 10%; Os sulcos são formados usando um molde plástico. Submergir a ponta da agulha em meio HBSS a 10% na placa de injeção. Aplique dois ou três pulsos de injeção para remover bolhas de ar na ponta. Para cada injeção, penetre no córion e no saco vitelínico em um único movimento e aplique um pulso de injeção. Este líquido injetado pode ser visto logo após a injeção como um pequeno esferoide dentro do saco vitelino. Este pequeno esferoide dissipa-se relativamente rapidamente. Repita este passo para outros embriões, até que um número suficiente de embriões injetados tenha sido obtido.NOTA: A taxa de sobrevivência dos embriões (injetados e não injetados) normalmente varia de 50% a 90%. Objetivar injetar o dobro do número de embriões necessários para cada grupo controle/experimental. No ensaio pull-down de biotina, 100-140 embriões viáveis são necessários para cada condição. No ensaio de qRT-PCR, cinco embriões viáveis são recomendados para cada condição. O tamanho da amostra para imagens de peixes vivos e ensaio de coloração de imunofluorescência de montagem inteira é definido pelo usuário; Recomenda-se ter pelo menos 20 embriões viáveis por condição para produzir bom poder estatístico na análise. Enxaguar os embriões injetados em uma nova placa de Petri de 10 cm contendo meio HBSS fresco a 10%.NOTA: Os embriões podem ser facilmente enxaguados dos sulcos usando um frasco de esguicho. Junte os embriões não injetados em outra placa.NOTA: Os embriões não injetados podem servir como controles de qualidade para a saúde dos peixes, expressão de proteínas basais, níveis de fluorescência de fundo, etc., conforme necessário. Se o procedimento de injeção funcionou bem, e o mRNA/morfolino injetado não for letal para os embriões, embriões injetados e não injetados devem ter viabilidade semelhante. 5. Z-REX Distribuir os embriões injetados em placas de 10 cm, de acordo com a configuração do experimento (i.e., número de grupos controle/experimento). Em uma sala escura com iluminação de luz vermelha, substitua a mídia por 30 mL de HBSS a 10% com ou sem 1 μM de Ht-PreHNE (alquino).NOTA: Ht-PreHNE (alquino) é um composto leve-lábil. Os embriões devem ser mantidos no escuro nas etapas seguintes. Incubar os embriões a 28,5 °C no escuro. A 30,5 hpf, em sala escura, substitua o meio por 30 mL frescos de HBSS a 10%.NOTA: Ao substituir o meio, remova o máximo possível do meio antigo. Isso é fundamental para remover a quantidade não ligada/excessiva de Ht-PreHNE (alquino) dos embriões. Incubar os embriões a 28,5 °C no escuro durante 30 minutos. Repita as etapas 5.4-5.5 mais duas vezes. Ligue a lâmpada UV (365 nm, 3 mW/cm2) por 5 min para pré-aquecer a lâmpada.NOTA: A etapa de pré-aquecimento da lâmpada deve ser executada antes da etapa 5.8. A potência da lâmpada é menor/instável nos primeiros minutos após ser ligada. A potência da lâmpada deve ser medida por um medidor UV regularmente. A 32 hpf, expor os embriões à luz UV.Opção 1: Para leituras a jusante, como imagens de peixes vivos, coloração de imunofluorescência de montagem inteira, análise de fluorescência em gel (acoplamento de clique com azida Cy5), RNA-seq ou qRT-PCR, exponha os embriões à luz UV por 3 min, girando as placas a cada 30 s. Opção 2: Para leituras a jusante, como o ensaio pull-down de biotina, exponha os embriões à luz UV por no máximo 5 min (e mínimo de 3 min), rodopiando as placas a cada 30 s e resfriando as placas no gelo por 1 min.NOTA: Se estiver usando sondas diferentes, o tempo de exposição à luz precisa ser otimizado, dependendo do t1/2 de fotouncaging para uma determinada sonda eletrofílica fotocaged e fonte de luz implantada. t1/2fotouncaging pode ser determinado usando procedimentos conhecidos8. Para Ht-PreHNE (alquino), t 1/2 é < 1 min3; Assim, o tempo indicado acima é suficiente. 6. Ensaios a jusante Opção 1: Ensaio fenotípico. Imagem ao vivo do repórter transgênico de neutrófilos/macrófagoslinhas de peixes, Tg(lyz:TagRFP) e Tg(mpeg1:eGFP) (Figura 2)Anestesiar os embriões por incubação a 4 °C por 10 min.NOTA: Recomenda-se ter pelo menos 20 embriões viáveis por condição. Retire os embriões não fertilizados/mortos da placa.NOTA: Os embriões não fertilizados/mortos são turvos/não transparentes, e podem ser identificados visualmente. Se uma alta taxa de mortalidade for observada, volte ao procedimento de injeção ou tente reduzir a concentração de mRNA ou morfolino. Descorionar os embriões com pinças afiadas. Segure o córion com um par de pinças, sem tocar nas larvas de peixes, e use o outro par de pinças para arrancar o córion. O embrião é frágil. Só toque no córion ao executar a descorionação.NOTA: É comum, especialmente em iniciantes, danificar alguns embriões durante a descorionação. Portanto, tenha sempre mais embriões do que o mínimo necessário. Montar os embriões em placa de agarose a 2% (preparada com meio HBSS a 10%) e fotografar os embriões com estereomicroscópio (campo claro e respectivos canais fluorescentes) (Figura 2A, C, G).NOTA: Após Z-REX [combinação de injeção de mRNA Halo-TeV-Keap1-2xHA e tratamento com Ht-PreHNE(alquino)], a depleção de neutrófilos (lyz:TagRFP) foi mais significativa em 36 hpf (4 h pós-Z-REX), enquanto a redução de macrófagos (mpeg1:eGFP) foi mais significativa em 34 hpf (2 h pós-Z-REX) (Figura 2E,F). Outros pontos de tempo podem ser usados se usar diferentes linhas de repórter, mRNA/morfolino ou sondas. O tempo de exposição e/ou ganho deve ser otimizado para visualização de células isoladas ou das (ultra)estruturas específicas desejadas. Conte o número de neutrófilos/macrófagos de cada peixe por ImageJ (NIH) (Figura 2B, D-F, H). Use a ferramenta Seleção à mão livre no ImageJ para circundar os peixes inteiros e use a opção Find Maxima para contar as células fluorescentes. Opção 2: Avaliação da rotulagem de destino. Acoplamento azida-clique de biotina e ensaio pull-down de biotina (Figura 3)Anestesiar os embriões por incubação a 4 °C. Isso geralmente leva 10 minutos.NOTA: Para obter lisado de peixe suficiente, 100-140 embriões viáveis são necessários para cada condição. Retire os embriões não fertilizados/mortos da placa. Realizar decorionação e deyolking. Execute as duas manipulações segurando o córion com um par de pinças afiadas, usando o outro par de pinças para penetrar no saco vitelínico e, em seguida, separando o saco vitelínico enquanto remove o córion para permitir que as proteínas da gema saiam.OBS: É fundamental remover as proteínas da gema nesta etapa. As proteínas vitelínicas abundantes na amostra interferem nas análises posteriores. Transfira os embriões desgemados para um tubo de 1,5 mL.OBS: Gire a placa para centralizar os embriões desgemidos, o que facilita a coleta. Os detritos mais leves do córion vencem durante esse processo. Após os embriões se acomodarem no fundo do tubo, retirar o sobrenadante e adicionar 1 mL de solução salina tamponada com HEPES resfriada (pH 7,6). Repita a etapa 6.2.5 mais duas vezes. (Opcional) Se não pretender prosseguir com o próximo passo imediatamente, remova o tampão, congele rapidamente as amostras em azoto líquido e armazene-as a -80 °C.NOTA: Os pellets de peixe desgemados podem ser congelados em azoto líquido e armazenados a -80 °C. As amostras congeladas por flash podem ser armazenadas a -80 °C por até 2 semanas. Ressuspenda os pellets de peixe em tampão de lise.NOTA: O tampão de lise (pH 7,6) é composto por 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,3 mM TCEP, 2x Roche cOmplete Mini inibidores de protease livres de EDTA e 0,1 mg/mL inibidor de tripsina de soja. Um embrião dá cerca de 2 μg de lisado. Use 100 μL de tampão de lise para cada 120 embriões. Dois inibidores de protease Roche cOmplete Mini livres de EDTA e inibidores de tripsina de soja devem ser adicionados ao tampão de lise imediatamente antes do uso. Adicione 20% v/v de contas de zircônia ao tubo. Vórtice por 20 s, congelamento instantâneo em nitrogênio líquido e descongelamento em banho-maria a 37 °C. Repita a etapa 6.2.10 mais duas vezes. Centrifugar a solução a 21.000 x g a 4 °C durante 10 min. Transfira o sobrenadante para um novo tubo pré-resfriado de 1,5 mL. Medir a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford. Diluir o lisado para 1 mg/ml. Para cada condição, transferir 170 μg de lisado para um tubo de 2 mL. Misturar o lisado do passo 6.2.16 com 0,2 mg/ml de protease TeV (S219V) e incubar a solução a 37 °C durante 30 minutos.NOTA: Para grupos não tratados com protease TeV, basta misturar o lisado com um voloume igual de tampão de lise à solução de protease TeV usada em outros grupos. Prepare uma mistura mestre de 10x para a reação de clique de biotina-azida: 10% p/v SDS, 10 mM CuSO4, 1 mM(TBTA), 1 mM biotina-azida e 20 mM TCEP.NOTA: Adicione TCEP à mistura imediatamente antes do passo 6.2.19. Adicionar 8,5 μL de t-BuOH e 17 μL de mistura mestra de reação de clique 10x ao lisado (digerido por protease TeV) da etapa 6.2.17. Vórtice, centrifugar e incubar a solução a 37 °C durante 15 minutos. Adicione mais 1 mM de TCEP à solução e, em seguida, vórtice, centrífuga e incube a solução a 37 °C por mais 15 min. O tempo de incubação para as etapas 6.2.19-6.2.20 é de 30 min no total.NOTA: Este suplemento de TCEP, um reagente redutor para gerar(I), melhora a eficiência da reação de clique. Adicionar 600 μL de etanol -20 °C a cada tubo, agitar a solução e incubá-la a -80 °C durante a noite.NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -80 °C por 1 semana; Caso contrário, prossiga com a próxima etapa imediatamente. Centrifugar a solução a 21.000 x g a 4 °C durante 1 h.OBS: Um pellet deve se formar no fundo do tubo após a centrifugação, que é a fração desejada. Retire o sobrenadante, adicione 1 mL de etanol -20 °C, vórtice e centrifugar a solução a 21.000 x g a 4 °C por 10 min. Repita a etapa 6.2.23. Retire o sobrenadante, adicione 1 ml de acetona -20 °C, vórtice e centrifugar a solução a 21.000 x g a 4 °C durante 10 minutos. Remova o sobrenadante. Deixe o excesso de acetona residual evaporar, embora não completamente para secar. Ressuspender o pellet em 100 μL de tampão de ressuspensão (8% p/v dodecil sulfato de lítio [LDS], 1 mM EDTA em solução salina HEPES 50 mM, pH 7,6), vórtice por 15 s e sonicate até que o pellet esteja dissolvido. Centrifugar a solução a 21.000 x g à temperatura ambiente (TR) durante 5 min. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 2 mL e adicionar 1,5 mL de solução salina HEPES 50 mM, pH 7,6.NOTA: A concentração final de LDS nesta etapa é de 0,5%. Concentrações mais altas de LDS podem prejudicar a eficiência de pull-down. Assim, embora o aumento da concentração de LDS possa auxiliar na redução da ligação não específica, também pode reduzir a eficiência do pulldown. Assim, recomenda-se não alterar a concentração de LDS nesta etapa. Coletar a amostra de “entrada” (Figura 3): transferir 30 μL de lisado de 1 mg/mL para um novo tubo de 1,5 mL e adicionar 10 μL de tampão de amostra Laemmli 4x contendo 6% de β-Mercaptoetanol (BME). Congele a solução e armazene-a a -80 °C. Transferir 100 μL de resina de alta capacidade de estreptavidina de volume leito para um novo tubo de 2 mL. Adicionar 1 mL de LDS a 0,5% em solução salina HEPES 50 mM (pH 7,6), centrifugar a 1.500 x g em TR por 2 min e retirar o sobrenadante. Repetir a lavagem com mais 1 mL de solução fisiológica a 0,5% LDS em solução salina HEPES 50 mM (pH 7,6). Transferir a solução do passo 6.2.29 para o tubo contendo resina de alta capacidade de estreptavidina pré-lavada a partir do passo 6.2.31 e incubar a solução num misturador de ponta a ponta em RT durante 4-6 horas. Centrifugar a mistura a 1.500 x g em RT durante 2 min, tomar 30 μL do sobrenadante e misturá-la com 10 μL de tampão de amostra Laemmli 4x contendo 6% de BME para a amostra de “flowthrough”. Em seguida, remova o sobrenadante restante.NOTA: As amostras de “Flowthrough” podem ser analisadas por western blotting para verificar a eficiência de pull-down da estreptavidina. É essencial remover o máximo possível do sobrenadante para lavar as proteínas não ligadas. Primeiro, remova a maior parte do sobrenadante usando uma pipeta P-1000 e, em seguida, remova o sobrenadante restante usando uma pipeta P-20 com uma ponta de carregamento de gel. Adicionar 1 mL de LDS a 0,5% em solução salina HEPES 50 mM (pH 7,6) à resina e incubar a mistura por 30 min no TR com rotação término-sobre-extremo. Centrifugar a mistura a 1.500 x g em TR por 2 min e retirar o sobrenadante.NOTA: Normalmente, 0,5% LDS é suficiente para remover a maioria das proteínas de ligação não específicas. Se sinais de ligação não específicos ainda forem vistos na análise posterior, a concentração de LDS no tampão de lavagem pode ser aumentada. Repita a etapa 6.2.34-6.2.35 mais duas vezes. Adicionar 40 μL de tampão de amostra 2x Laemmli contendo 6% de BME à resina. Eluir as proteínas ligadas incubando a mistura a 98 °C durante 5 min. Centrifugar a mistura a 21.000 x g em TR por 5 min e transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL. Esta é a amostra “eluída”.NOTA: O carregamento directo da solução contendo resina do passo 6.2.38 no gel pode afectar a análise SDS-PAGE. Carregar 20 μL em cada poço de gel de poliacrilamida a 10% de 10 pistas e executar eletroforese em gel.NOTA: Execute o gel em uma tensão mais baixa (120 V) até que a frente do corante atinja o gel de resolução e altere a tensão para 170 V. Pare o programa depois que a frente do corante sair. Realizar western blotting com anti-HA, anti-Halo ou outros anticorpos que detectem proteínas housekeeping (Figura 3). Opção 3: Análise transcriptômica. RNA-seq e qRT-PCR (Figura 4)NOTA: Recomenda-se vivamente a utilização de embriões colocados dentro de 15 minutos um do outro para este ensaio. A diferença de idade dos embriões afeta significativamente os resultados do ensaio.Anestesiar os embriões incubando-os a 4 °C por 10 min, 2 h após Z-REX. Realizar a descorionação com pinça afiada (passo 6.1.3). (Opcional) Realizar segmentação com pinça (por exemplo, separar a cabeça da cauda) se diferentes segmentos forem analisados separadamente. Se extrair RNA de um embrião inteiro, transfira de três a cinco embriões para um tubo de 1,5 mL. Se extrair RNA da cabeça ou cauda, transferir 10-12 segmentos dissecados para um tubo de 1,5 mL.OBS: Recomenda-se a realização do experimento com três a cinco repetições biológicas. Adicionar 1 mL do reagente TRIzol e esferas de vidro ao tubo.NOTA: Verificou-se que as esferas de vidro funcionam melhor do que as contas de zircônia para extração de RNA. Vórtice a mistura por 30 s.NOTA: Se não prosseguir com o próximo passo imediatamente, a solução pode ser armazenada a -80 °C por 1 a 3 semanas. Extraia o RNA de acordo com as instruções do fabricante. Avaliar a qualidade e concentração do RNA por espectrofotômetro de microvolume e eletroforese em gel de agarose.NOTA: RNA de boa qualidade deve ter uma relação A260/A280 em torno ou acima de 2,0. Submeter o RNA para sequenciamento, ou tratar 1 μg de RNA com DNase I grau de amplificação, e transcrever reversamente usando transcriptase reversa sobrescrita III e oligo-(dT)20. Execute esta etapa de acordo com as instruções do fabricante. Realizar qRT-PCR e analisar os dados pelo método ΔΔCT9 (Figura 4B-D). Opção 4: Análise de expressão e colocalização de POI. Ensaio de imunofluorescência total (Figura 5)NOTA: Os embriões fixados em formaldeído são frágeis. Evite tremores vigorosos e manuseie com cuidado.Descorionar os embriões seguindo os passos 6.1.1-6.1.3. Transferir os embriões para um tubo de 1,5 mL.NOTA: Cada trompa deve ter um número igual de embriões, e não mais de 40 embriões. Após os embriões se acomodarem no fundo do tubo, retirar o sobrenadante e adicionar 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,6). Repita a etapa 6.4.3 mais uma vez. Retire o sobrenadante, adicione 1 mL de formaldeído a 4% em PBS (pH 7,6) e incube o tubo a 4 °C durante a noite com balanço suave.NOTA: As amostras em solução de formaldeído podem ser armazenadas a 4 °C durante 1 semana. Retire o sobrenadante, adicione 1 ml de metanol -20 °C e incube o tubo de lado a -20 °C durante, pelo menos, 18 horas.NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -20 °C por 1 mês ou mais. Remova o sobrenadante e adicione 1 mL de tampão PDT (0,3% v/v Triton X-100, 0,1% v/v Tween-20 e 1% v/v dimetilsulfóxido [DMSO] em tampão PBS). Repetir o passo 6.4.7 e incubar o tubo em RT durante 30 minutos com um balanço suave. Remover o sobrenadante, adicionar 1 mL de tampão de bloqueio (10% v/v de soro fetal bovino [SFB] inativado pelo calor, 2% p/v de albumina de soro bovino [BSA] e 0,1% v/v de Tween-20 em tampão PBS) e incubar o tubo em TR por 1 h com balanço suave. Remover o sobrenadante e adicionar 200 μL de solução de anticorpos primários (diluída em tampão de bloqueio). Retire o sobrenadante, adicione 500 μL de solução de anticorpos primários (diluída em tampão de bloqueio) e incube o tubo a 4 °C durante a noite com balanço suave.NOTA: Se usar um novo anticorpo primário, vale a pena incluir algumas amostras sem coloração de anticorpos primários para servir como controles negativos. No entanto, idealmente, embriões knockdown morfolino ou nocaute genético modificado, ou embriões em que a expressão da proteína-alvo foi estimulada, são meios mais confiáveis para validar o anticorpo. Retire o sobrenadante, adicione 1 mL de tampão PDT e incube o tubo em TR por 30 min com balanço suave. Repita a etapa 6.4.12. Retire o sobrenadante, adicione 1 mL de tampão de bloqueio e incube o tubo em TR por 1 h com balanço suave.NOTA: As amostras devem ser protegidas da luz após esta etapa, para evitar o fotobranqueamento do fluoróforo conjugado no anticorpo secundário. Remover o sobrenadante e adicionar 200 μL de solução de anticorpos secundários (diluída em tampão de bloqueio). Remover o sobrenadante, adicionar 500 μL de solução de anticorpos secundários (diluída em tampão de bloqueio) e incubar o tubo em TR durante 1,5 h com balanço suave. Retire o sobrenadante, adicione 1 mL de tampão PDT e incube o tubo em TR por 30 min com balanço suave. Repita a etapa 6.4.17. Montar os embriões em placa de agarose a 2% (confeccionada com PBS, pH 7,6) e obter imagens dos embriões com estereomicroscópio (campo claro e respectivos canais fluorescentes) (Figura 5A,B,D,F).NOTA: Se estiver usando o estereomicroscópio de fluorescência Leica M165 FC, use uma ampliação de 25x para obter imagens com boa resolução. Quantificar/analisar a intensidade do sinal fluorescente pelo ImageJ (NIH). Use a ferramenta Freehand Selection no ImageJ para quantificar o sinal na região de interesse.