Surveillance des réponses de signalisation ciblée chez les larves de poisson-zèbre - Z-REX démasque les mécanismes précis des médicaments électrophiles et des métabolites

Les procédures d’élevage et de manipulation du poisson zèbre à l’Université Cornell (États-Unis) ont été effectuées conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH) et approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Les procédures d’élevage et de manipulation du poisson zèbre de l’Unité de la polytechnique fédérale de Lausanne (EPFL, Suisse) ont été effectuées conformément à la loi sur la protection des animaux RS 455 et à l’ordonnance sur la protection des animaux RS 455.1, avec autorisation vétérinaire cantonale VD-H23. NOTE: Dans ce protocole, les lignées de poissons Tg( lyz:TagRFP ) et Tg(mpeg1:EGFP) exprimant Halo-TeV-Keap1 sont utilisées pour démontrer Z-REX. La méthode peut être étendue à d’autres protéines d’intérêt, à des lignées de poissons rapporteurs transgéniques et à des essais biologiques en aval. Voir le tableau supplémentaire 1 pour connaître les tampons utilisés dans la présente étude. Tous les réactifs, instruments, équipements, anticorps, plasmides, souches de poisson zèbre et équipements sont énumérés dans le tableau des matériaux. 1. Préparation de l’ARNm Préparez l’ARNm Halo-TeV-Keap1-2xHA et Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA à l’aide du kit de transcription in vitro mMessage mMachine SP6.REMARQUE : Suivez les instructions du fabricant et effectuez des réactions à l’échelle de 40 μL pour chaque ARNm. Redissoudre la pastille d’ARNm dans 10 μL d’eau exempte de nucléase. Évaluer la qualité de l’ARNm et mesurer la concentration par spectrophotomètre de microvolume et électrophorèse sur gel d’agarose. Un ARNm de bonne qualité devrait avoir un rapport A260/A280 d’environ ou plus de 2,0. Diluer l’ARNm à 1-1,5 mg/mL avec de l’eau sans nucléase. Aliquote la solution d’ARNm (1-2 μL par tube) et stocker les aliquotes à -80 °C. 2. Production d’embryons de poissons Option 1 : Production d’embryons de poissons de type sauvage (WT).Mettre en place 10 paires de poissons croisés dans 10 bassins distincts, chaque réservoir contenant un séparateur entre les poissons parents mâles et femelles.NOTE: Un total de 10 paires croisées fournit généralement un nombre suffisant d’embryons pour les essais. Le nombre de couples croisés peut être ajusté en fonction de la conception ou du besoin de l’expérience et de la fécondité du poisson parent. Le lendemain matin, après avoir installé l’injecteur, retirez les séparateurs dans cinq des réservoirs. Attendez 30 minutes pour que le poisson s’accouple. Déplacez le poisson parent dans un autre réservoir, collectez les embryons en faisant passer l’eau du réservoir dans une passoire, puis rincez les embryons de la passoire dans une boîte de Petri de 10 cm. Ces embryons seront utilisés pour la première série d’injections.REMARQUE : Si la qualité des œufs d’un certain lot est médiocre (p. ex., les œufs sont opaques en raison de l’agrégation des protéines), ne les mettez pas en commun avec les autres embryons. (Facultatif) Effectuer des procédures similaires à celles décrites aux étapes 2.1.2 à 2.1.3 sur les cinq autres réservoirs pour le prochain cycle d’injection.REMARQUE: Il est préférable de n’effectuer qu’une seule série d’injection, afin de minimiser la différence d’âge entre les embryons. Cependant, si plus d’embryons que ce qui peut être injecté dans un lot est nécessaire, il est recommandé d’effectuer deux cycles d’injection pour s’assurer que les embryons restent à un stade de 1 à 4 cellules pendant l’injection d’ARNm. Le nombre de cycles d’injection peut être ajusté en fonction de la compétence d’injection de l’opérateur et de la conception de l’expérience. Cependant, il est suggéré d’effectuer toute la procédure (du retrait du premier diviseur à l’injection du dernier embryon) dans les 2 heures. Une grande différence d’âge entre les embryons peut nuire à la fiabilité et à la reproductibilité des résultats de l’expérience. Option 2 : Produire des embryons de poissons rapporteurs hétérozygotes transgéniques neutrophiles/macrophages.Mettez en place 10 paires de poissons croisés dans 10 bassins distincts, chaque réservoir étant inséré avec un séparateur entre les poissons parents mâles et femelles : WT fish versus Tg( lyz:TagRFP), ou WT fish versus Tg(mpeg1:eGFP).REMARQUE : Évitez les croisements entre poissons transgéniques hétérozygotes, qui peuvent affecter les lectures fluorescentes en aval, car les poissons rapporteurs homozygotes présentent un signal fluorescent plus élevé que les poissons hétérozygotes. Les lignées rapporteures transgéniques et les embryons WT peuvent être facilement distingués lors de l’imagerie. Avoir un mélange d’embryons WT et hétérozygotes dans le même pool n’est pas un problème. lyz:TagRFP signale les neutrophiles, et mpeg:eGFP rapporte les macrophages. Ce protocole peut également être appliqué à d’autres lignées de poissons rapporteurs. Suivez les étapes 2.1.2-2.1.4. 3. Configuration du micro-injecteur Allumez la source d’air, réglez la contre-pression sur 0,2-0,5 psi et réglez la pression d’injection sur 25-30 psi. La plage spécifique de pression indiquée est généralement recommandée.REMARQUE: Il est essentiel d’avoir une contre-pression stable pour empêcher le reflux du milieu de poisson dans l’aiguille. Lors de l’étalonnage du volume d’injection à l’étape 3.8, seul le temps d’injection doit être modifié. Ne modifiez pas la pression d’injection dans les étapes suivantes; Une faible pression d’injection peut entraîner un échec de l’injection en raison de la tension superficielle et interfaciale, tandis qu’une pression d’injection élevée peut endommager les embryons. Nettoyez l’équipement et la plateforme d’injection avec la solution de décontamination RNase.REMARQUE: La RNase, qui dégrade l’ARNm, peut provenir de l’opérateur ou de l’équipement. Il est nécessaire d’effectuer le nettoyage avant l’expérience et de porter des gants. (Facultatif) Si vous co-injectez de l’ARNm et du morpholino, prémélangez les deux dans un tube de 0,2 mL.REMARQUE: Z-REX fonctionne bien en utilisant une solution d’ARNm Halo-TeV-Keap1-2xHA avec une concentration de 250-1500 ng / μL. Plusieurs morpholinos ont également été utilisés chez le poisson zèbre, et les concentrations optimales ont été rapportées7. En cas d’utilisation d’un morpholino dont la séquence n’a pas été publiée, l’opérateur doit d’abord évaluer la toxicité et l’efficacité du gène knockdown du morpholino avant de l’utiliser dans Z-REX. Transférer 1 à 2 μL d’ARNm (et/ou de morpholino, le cas échéant7) dans une aiguille d’injection à l’aide d’une pointe de pipette à microchargeur.REMARQUE: Si vous préparez des aiguilles avec un extracteur de micropipettes Flaming/Brown, la configuration est la suivante. Chaleur: 520 unités; force de traction: 60 unités; vélocité: 70 unités; retard : 155 unités; pression: 550 unités; Rampe : 530 unités. Installez l’aiguille sur le manipulateur de micro-injection.REMARQUE: La contre-pression de la source d’air doit pousser la solution d’ARNm (/ morpholino) à la pointe de l’aiguille. Utilisez une pince tranchante ou une lame de rasoir pour casser la pointe de l’aiguille, créant ainsi une ouverture appropriée pour l’injection. Immergez la pointe de l’aiguille dans de l’huile minérale sur un micromètre de scène. Appliquez deux ou trois impulsions d’injection pour éliminer les bulles d’air dans la pointe. Calibrer la taille de la goutte à 2 nL en modifiant le temps d’injection.REMARQUE: Ceci est mieux effectué en injectant dans de l’huile minérale (qui imite la viscosité du sac vitellin) posée sur un hémocytomètre. À l’aide d’un microscope, utilisez le quadrillage de l’hémocytomètre pour estimer la taille de la gouttelette formée pendant l’injection et ajustez le temps d’injection en conséquence. Bien que le colorant rouge de phénol soit parfois utilisé, sa nécessité dans la procédure d’injection d’ARNm décrite ici n’a pas été observée. 4. Micro-injection Remplir une plaque d’injection avec un milieu frais de solution saline équilibrée (HBSS) à 10 % et aligner les embryons dans les rainures de la plaque avec une pince émoussée.NOTE: La plaque d’injection est préparée avec de l’agarose à 2% dans un milieu HBSS à 10%; Les rainures sont formées à l’aide d’un moule en plastique. Immerger l’extrémité de l’aiguille dans un milieu HBSS à 10% dans la plaque d’injection. Appliquez deux ou trois impulsions d’injection pour éliminer les bulles d’air dans la pointe. Pour chaque injection, pénétrez le chorion et le sac vitellin en un seul mouvement et appliquez une impulsion d’injection. Ce liquide injecté peut être vu juste après l’injection comme un petit sphéroïde dans le sac vitellin. Ce petit sphéroïde se dissipe relativement rapidement. Répétez cette étape pour les autres embryons, jusqu’à ce qu’un nombre suffisant d’embryons injectés ait été obtenu.REMARQUE: Le taux de survie des embryons (injectés et non injectés) varie généralement de 50% à 90%. Viser à injecter le double du nombre d’embryons nécessaires pour chaque groupe témoin/expérimental. Dans le test d’extraction de biotine, 100 à 140 embryons viables sont nécessaires pour chaque condition. Dans le test qRT-PCR, cinq embryons viables sont recommandés pour chaque condition. La taille de l’échantillon pour l’imagerie des poissons vivants et le test de coloration par immunofluorescence à montage entier est définie par l’utilisateur; Il est recommandé d’avoir au moins 20 embryons viables par condition pour donner une bonne puissance statistique dans l’analyse. Rincer les embryons injectés dans une nouvelle boîte de Petri de 10 cm contenant des milieux frais HBSS à 10%.REMARQUE: Les embryons peuvent être facilement rincés des rainures à l’aide d’un flacon à gicler. Mettez en commun les embryons non injectés dans une autre plaque.REMARQUE : Les embryons non injectés peuvent servir de contrôles de qualité pour la santé du poisson, l’expression des protéines de base, les niveaux de fluorescence de fond, etc., au besoin. Si la procédure d’injection a bien fonctionné et que l’ARNm/morpholino injecté n’est pas mortel pour les embryons, les embryons injectés et non injectés devraient avoir une viabilité similaire. 5. Z-REX Répartir les embryons injectés dans des boîtes de 10 cm, selon la configuration de l’expérience (c.-à-d. le nombre de groupes témoins/expérimentaux). Dans une pièce sombre avec éclairage rouge, remplacez le média par 30 ml d’HBSS à 10 % avec ou sans 1 μM de Ht-PreHNE (alcyne).REMARQUE: Ht-PreHNE (alcyne) est un composé labile à la lumière. Les embryons doivent être conservés dans l’obscurité dans les étapes suivantes. Incuber les embryons à 28,5 °C dans l’obscurité. À 30,5 hpf, dans une pièce sombre, remplacez le média par un nouveau 30 ml de HBSS à 10%.REMARQUE: Lorsque vous remplacez le support, retirez autant que possible l’ancien support. Ceci est essentiel pour éliminer la quantité non liée / excessive de Ht-PreHNE (alcyne) des embryons. Incuber les embryons à 28,5 °C dans l’obscurité pendant 30 min. Répétez les étapes 5.4-5.5 deux fois de plus. Allumez la lampe UV (365 nm, 3 mW/cm2) pendant 5 min pour préchauffer la lampe.NOTA: L’étape de préchauffage de la lampe doit être effectuée avant l’étape 5.8. La puissance de la lampe est plus faible/instable dans les premières minutes après avoir été allumée. La puissance de la lampe doit être mesurée régulièrement par un compteur UV. À 32 hpf, exposer les embryons à la lumière UV.Option 1 : Pour les lectures en aval, telles que l’imagerie de poissons vivants, la coloration par immunofluorescence à montage entier, l’analyse de fluorescence dans le gel (couplage de clic avec azoture de Cy5), le séquençage de l’ARN ou la qRT-PCR, exposez les embryons à la lumière UV pendant 3 minutes, en faisant tourbillonner les plaques toutes les 30 s. Option 2 : Pour les lectures en aval, comme le test d’extraction de biotine, exposer les embryons à la lumière UV pendant un maximum de 5 minutes (et au moins 3 minutes), en faisant tourbillonner les plaques toutes les 30 s et refroidir les plaques sur de la glace pendant 1 min.REMARQUE: Si vous utilisez différentes sondes, le temps d’exposition à la lumière doit être optimisé, en fonction de la t1/2 de photodécancage pour une sonde électrophile photocage donnée et une source lumineuse déployée. Laphotodécancage t 1/2 peut être déterminée à l’aide des procédures connues8. Pour Ht-PreHNE(alcyne), t 1/2 est < 1 min3 ; Ainsi, le temps indiqué ci-dessus est suffisant. 6. Essais en aval Option 1 : Dosage phénotypique. Imagerie en direct d’un rapporteur de neutrophiles/macrophages transgéniqueslignées de poissons, Tg(lyz:TagRFP) et Tg(mpeg1:eGFP) (Figure 2)Anesthésier les embryons par incubation à 4 °C pendant 10 min.NOTE: Il est recommandé d’avoir au moins 20 embryons viables par condition. Retirez les embryons non fécondés/morts de l’assiette.REMARQUE: Les embryons non fécondés / morts sont nuageux / non transparents et peuvent être identifiés visuellement. Si un taux de mortalité élevé est observé, revenez à la procédure d’injection ou essayez de réduire la concentration d’ARNm ou de morpholino. Déchorioner les embryons avec une pince tranchante. Tenez le chorion avec une paire de pinces, sans toucher le poisson larvaire, et utilisez l’autre paire de pinces pour arracher le chorion. L’embryon est fragile. Ne touchez le chorion que lors de la dechorionation.NOTE: Il est fréquent, surtout chez les débutants, d’endommager certains embryons pendant la dérorionation. Par conséquent, ayez toujours plus d’embryons que le minimum nécessaire. Montez les embryons sur une plaque d’agarose à 2% (préparée avec 10% de milieu HBSS) et imagez les embryons avec un stéréomicroscope (champ lumineux et canaux fluorescents respectifs) (Figure 2A, C, G).NOTE: Après Z-REX [combinaison de Halo-TeV-Keap1-2xHA injection d’ARNm et Ht-PreHNE (alcyne)], la déplétion des neutrophiles (lyz:TagRFP) s’est avérée plus significative à 36 hpf (4 h après Z-REX), tandis que la réduction des macrophages (mpeg1:eGFP) était plus significative à 34 hpf (2 h après Z-REX) (Figure 2E,F). D’autres points temporels peuvent être utilisés si vous utilisez différentes lignes rapporteures, ARNm/morpholino ou sondes. Le temps d’exposition et/ou le gain doivent être optimisés pour visualiser des cellules individuelles ou les (ultra)structures spécifiques souhaitées. Compter le nombre de neutrophiles/macrophages de chaque poisson par ImageJ (NIH) (Figure 2B, D-F, H). Utilisez l’outil Sélection à main levée dans ImageJ pour encercler le poisson entier et utilisez l’option Trouver des maxima pour compter les cellules fluorescentes. Option 2 : Évaluation de l’étiquetage des cibles. Couplage azoté-clic à l’azoture de biotine et dosage de l’abaissement de la biotine (Graphique 3)Anesthésier les embryons par incubation à 4 °C. Cela prend généralement 10 min.REMARQUE: Pour obtenir suffisamment de lysat de poisson, 100 à 140 embryons viables sont nécessaires pour chaque condition. Retirez les embryons non fécondés/morts de l’assiette. Effectuer la déchorionation et le déyolking. Effectuez les deux manipulations en tenant le chorion avec une paire de pinces tranchantes, en utilisant l’autre paire de forceps pour pénétrer dans le sac vitellin, puis en séparant le sac vitellin tout en retirant le chorion pour permettre aux protéines vitelliniques de sortir.REMARQUE: Il est essentiel d’éliminer les protéines vitellines dans cette étape. Les protéines vitellines abondantes dans l’échantillon interfèrent avec une analyse ultérieure. Transférer les embryons ébilolés dans un tube de 1,5 mL.REMARQUE: Remuez la plaque pour centrer les embryons éblôlés, ce qui facilite la collecte. Les débris de chorion plus légers disparaissent au cours de ce processus. Une fois que les embryons se sont installés au fond du tube, retirez le surnageant et ajoutez 1 mL de solution saline refroidie tamponnée HEPES (pH 7,6). Répétez l’étape 6.2.5 deux fois de plus. (Facultatif) Si vous n’avez pas l’intention de passer immédiatement à l’étape suivante, retirez le tampon, congelez les échantillons dans de l’azote liquide et conservez-les à -80 °C.NOTE: Les granulés de poisson éblouis peuvent être surgelés dans de l’azote liquide et stockés à -80 ° C. Les échantillons surgelés peuvent être conservés à -80 °C jusqu’à 2 semaines. Remettez en suspension les granulés de poisson dans un tampon de lyse.REMARQUE : Le tampon de lyse (pH 7,6) est composé de 50 mM HEPES, 100 mM de NaCl, 1 % de Triton X-100, 0,3 mM de PTCE, 2 inhibiteurs de la protéase sans EDTA Roche cOmplete Mini et 0,1 mg/mL d’inhibiteur de trypsine de soja. Un embryon donne environ 2 μg de lysat. Utilisez 100 μL de tampon de lyse pour 120 embryons. Deux inhibiteurs de la protéase sans EDTA Roche cOmplete Mini et inhibiteurs de trypsine de soja doivent être ajoutés au tampon de lyse juste avant utilisation. Ajouter 20% de billes de zircone v/v dans le tube. Vortex pendant 20 s, congélation instantanée dans de l’azote liquide et décongélation au bain-marie à 37 °C. Répétez l’étape 6.2.10 deux fois de plus. Centrifuger la solution à 21 000 x g à 4 °C pendant 10 min. Transférer le surnageant dans un nouveau tube prérefroidi de 1,5 mL. Mesurer la concentration en protéines par le test de Bradford. Diluer le lysat à 1 mg/mL. Pour chaque condition, transférer 170 μg de lysat dans un tube de 2 mL. Mélanger le lysat de l’étape 6.2.16 avec 0,2 mg/mL de protéase TeV (S219V) et incuber la solution à 37 °C pendant 30 min.REMARQUE: Pour les groupes non traités par protéase TeV, il suffit de mélanger le lysat avec un volume égal de tampon de lyse à la solution de protéase TeV utilisée dans d’autres groupes. Préparer un mélange maître 10x pour la réaction de clic biotine-azoture : 10 % p/v SDS, 10 mM CuSO4, 1 mM Cu(TBTA), 1 mM biotin-azide, et 20 mM TCEP.REMARQUE : Ajouter le PTCE au mélange juste avant l’étape 6.2.19. Ajouter 8,5 μL de t-BuOH et 17 μL de mélange maître de réaction 10x clic au lysat (TeV digéré par la protéase) de l’étape 6.2.17. Vortex, centrifuger et incuber la solution à 37 °C pendant 15 min. Ajouter un autre PTCE de 1 mM à la solution, puis vortex, centrifuger et incuber la solution à 37 °C pendant encore 15 minutes. Le temps d’incubation pour les étapes 6.2.19-6.2.20 est de 30 min au total.REMARQUE: Ce supplément de TCEP, un réactif réducteur pour générer du Cu (I), améliore l’efficacité de la réaction au clic. Ajouter 600 μL d’éthanol à -20 °C dans chaque tube, vortex la solution et l’incuber à -80 °C pendant la nuit.NOTE: Les échantillons peuvent être conservés à -80 ° C pendant 1 semaine; Si ce n’est pas le cas, passez immédiatement à l’étape suivante. Centrifuger la solution à 21 000 x g à 4 °C pendant 1 h.REMARQUE: Une pastille doit se former dans le fond du tube après centrifugation, qui est la fraction désirée. Retirer le surnageant, ajouter 1 mL d’éthanol à -20 °C, vortex et centrifuger la solution à 21 000 x g à 4 °C pendant 10 min. Répétez l’étape 6.2.23. Retirer le surnageant, ajouter 1 mL d’acétone -20 °C, vortex, et centrifuger la solution à 21 000 x g à 4 °C pendant 10 min. Retirez le surnageant. Laisser l’excès d’acétone résiduelle s’évaporer, mais pas complètement sec. Resuspendre la pastille dans 100 μL de tampon de remise en suspension (8 % p/v de sulfate de dodécyle de lithium [LDS], 1 mM d’EDTA dans une solution saline HEPES 50 mM, pH 7,6), vortex pendant 15 s et soniquer jusqu’à dissolution de la pastille. Centrifuger la solution à 21 000 x g à température ambiante (RT) pendant 5 min. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 2 mL et ajouter 1,5 mL de solution saline HEPES 50 mM, pH 7,6.NOTE: La concentration finale de LDS dans cette étape est de 0,5%. Des concentrations plus élevées de LDS peuvent nuire à l’efficacité de la descente. Ainsi, bien que l’augmentation de la concentration LDS puisse aider à réduire la liaison non spécifique, elle peut également réduire l’efficacité du pulldown. Par conséquent, il est recommandé de ne pas modifier la concentration de LDS à cette étape. Prélever l’échantillon « d’entrée » (figure 3) : transférer 30 μL de lysat à 1 mg/mL dans un nouveau tube de 1,5 mL et ajouter 10 μL de 4x tampon d’échantillon Laemmli contenant 6 % de β-mercaptoéthanol (BME). Congelez la solution et conservez-la à -80 °C. Transférer 100 μL de résine de streptavidine haute capacité à volume de lit dans un nouveau tube de 2 mL. Ajouter 1 mL de LDS à 0,5 % dans une solution saline HEPES de 50 mM (pH 7,6), centrifuger à 1 500 x g à TA pendant 2 min et retirer le surnageant. Répétez le lavage avec 1 mL de LDS à 0,5 % dans une solution saline HEPES de 50 mM (pH 7,6). Transférer la solution de l’étape 6.2.29 dans le tube contenant la résine de streptavidine haute capacité prélavée de l’étape 6.2.31 et incuber la solution sur un mélangeur bout à bout à TA pendant 4 à 6 h. Centrifuger le mélange à 1 500 x g à TA pendant 2 min, prélever 30 μL du surnageant et le mélanger avec 10 μL de tampon d’échantillon de Laemmli 4x contenant 6 % de BME pour l’échantillon « à flux continu ». Ensuite, retirez le surnageant restant.REMARQUE : Les échantillons « à flux continu » peuvent être analysés par transfert Western pour vérifier l’efficacité de l’abaissement de la streptavidine. Il est essentiel d’éliminer autant de surnageant que possible pour éliminer les protéines non liées. Tout d’abord, retirez la majeure partie du surnageant à l’aide d’une pipette P-1000, puis retirez le surnageant restant à l’aide d’une pipette P-20 munie d’un embout de chargement en gel. Ajouter 1 mL de LDS à 0,5 % dans une solution saline HEPES 50 mM (pH 7,6) à la résine et incuber le mélange pendant 30 minutes à TA avec rotation de bout en bout. Centrifuger le mélange à 1 500 x g à TA pendant 2 min, et retirer le surnageant.REMARQUE: En règle générale, 0,5% LDS est suffisant pour éliminer la plupart des protéines de liaison non spécifiques. Si des signaux de liaison non spécifiques sont encore observés dans l’analyse ultérieure, la concentration de LDS dans le tampon de lavage peut être augmentée. Répétez l’étape 6.2.34-6.2.35 deux fois de plus. Ajouter 40 μL de 2x tampon d’échantillon Laemmli contenant 6% de BME à la résine. Éluer les protéines liées en incubant le mélange à 98 °C pendant 5 min. Centrifuger le mélange à 21 000 x g à TA pendant 5 minutes et transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL. C’est l’échantillon « élu ».NOTE: Le chargement direct de la solution contenant de la résine de l’étape 6.2.38 dans le gel peut affecter l’analyse SDS-PAGE. Charger 20 μL dans chaque puits de gel de polyacrylamide à 10 % à 10 voies et exécuter l’électrophorèse sur gel.REMARQUE: Exécutez le gel à une tension inférieure (120 V) jusqu’à ce que le front de colorant atteigne le gel de résolution et modifiez la tension à 170 V. Arrêtez le programme après la sortie du front de colorant. Effectuez le Western blot avec des anticorps anti-HA, anti-Halo ou autres détectant les protéines ménagères (Figure 3). Option 3 : Analyse transcriptomique. RNA-seq et qRT-PCR (Figure 4)NOTE: Il est fortement recommandé d’utiliser des embryons pondus à moins de 15 minutes les uns des autres pour ce test. La différence d’âge des embryons affecte de manière significative les résultats du test.Anesthésier les embryons en les incubant à 4 °C pendant 10 min, 2 h après Z-REX. Effectuer la déchorionation à l’aide d’une pince tranchante (étape 6.1.3). (Facultatif) Effectuer une segmentation à l’aide d’une pince (p. ex., séparer la tête de la queue) si différents segments doivent être analysés séparément. Si vous extrayez de l’ARN d’un embryon entier, transférez trois à cinq embryons dans un tube de 1,5 mL. Si vous extrayez l’ARN de la tête ou de la queue, transférer 10 à 12 segments disséqués dans un tube de 1,5 mL.NOTE: Il est recommandé d’effectuer l’expérience avec trois à cinq répétitions biologiques. Ajouter 1 mL de réactif TRIzol et de billes de verre dans le tube.REMARQUE: Il a été constaté que les billes de verre fonctionnent mieux que les perles de zircone pour l’extraction de l’ARN. Vortex le mélange pendant 30 s.REMARQUE: Si vous ne passez pas immédiatement à l’étape suivante, la solution peut être conservée à -80 ° C pendant 1 à 3 semaines. Extraire l’ARN selon les instructions du fabricant. Évaluer la qualité et la concentration de l’ARN par spectrophotomètre de microvolume et électrophorèse sur gel d’agarose.REMARQUE: L’ARN de bonne qualité doit avoir un rapport A260/A280 d’environ ou plus de 2,0. Soit soumettre l’ARN pour séquençage, soit traiter 1 μg d’ARN avec de la DNase I de qualité amplification, et transcrire en inverse en exposant III transcriptase inverse et oligo-(dT)20. Effectuez cette étape conformément aux instructions du fabricant. Effectuer la qRT-PCR et analyser les données par la méthode ΔΔCT9 (Figure 4B-D). Option 4 : Analyse de l’expression et de la colocalisation des POI. Essai de coloration par immunofluorescence à montage entier (Figure 5)NOTE: Les embryons fixés au formaldéhyde sont fragiles. Évitez les secousses vigoureuses et manipulez avec précaution.Déchorioner les embryons en suivant les étapes 6.1.1-6.1.3. Transférer les embryons dans un tube de 1,5 mL.NOTE: Chaque tube doit avoir un nombre égal d’embryons, et pas plus de 40 embryons. Une fois que les embryons se sont déposés au fond du tube, retirez le surnageant et ajoutez 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH 7,6). Répétez l’étape 6.4.3 une fois de plus. Retirer le surnageant, ajouter 1 mL de formaldéhyde à 4 % dans du PBS (pH 7,6) et incuber le tube à 4 °C pendant une nuit en berçant doucement.NOTE: Les échantillons dans une solution de formaldéhyde peuvent être conservés à 4 ° C pendant 1 semaine. Retirer le surnageant, ajouter 1 mL de méthanol à -20 °C et incuber le tube sur le côté à -20 °C pendant au moins 18 h.REMARQUE: Les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C pendant 1 mois ou plus. Retirer le surnageant et ajouter 1 mL de tampon PDT (0,3 % v/v Triton X-100, 0,1 % v/v Tween-20 et 1 % v/v diméthylsulfoxyde [DMSO] dans le tampon PBS). Répétez l’étape 6.4.7 et incuber le tube à TA pendant 30 min en berçant doucement. Retirer le surnageant, ajouter 1 mL de tampon bloquant (sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur à 10 % v/v, albumine sérique bovine [BSA] à 2 % p/v et Tween-20 à 0,1 % v/v dans un tampon PBS) et incuber le tube à TA pendant 1 h en balançant doucement. Retirer le surnageant et ajouter 200 μL de solution d’anticorps primaires (diluée dans un tampon de blocage). Retirer le surnageant, ajouter 500 μL de solution d’anticorps primaires (diluée dans un tampon de blocage) et incuber le tube à 4 °C pendant une nuit en berçant doucement.REMARQUE: Si vous utilisez un nouvel anticorps primaire, il vaut la peine d’inclure certains échantillons sans coloration d’anticorps primaire pour servir de témoins négatifs. Cependant, idéalement, les embryons morpholino-knockdown ou modifiés, ou les embryons dans lesquels l’expression de la protéine cible a été stimulée, sont des moyens plus fiables de valider l’anticorps. Retirer le surnageant, ajouter 1 mL de tampon PDT et incuber le tube à TA pendant 30 min en balançant doucement. Répétez l’étape 6.4.12. Retirer le surnageant, ajouter 1 mL de tampon bloquant et incuber le tube à TA pendant 1 h en berçant doucement.REMARQUE: Les échantillons doivent être protégés de la lumière après cette étape, afin d’éviter le photoblanchiment du fluorophore conjugué sur l’anticorps secondaire. Retirer le surnageant et ajouter 200 μL de solution d’anticorps secondaires (diluée dans un tampon bloquant). Retirer le surnageant, ajouter 500 μL de solution d’anticorps secondaires (diluée dans un tampon de blocage) et incuber le tube à TA pendant 1,5 h en berçant doucement. Retirer le surnageant, ajouter 1 mL de tampon PDT et incuber le tube à TA pendant 30 min en balançant doucement. Répétez l’étape 6.4.17. Montez les embryons sur une plaque d’agarose à 2% (faite avec PBS, pH 7,6) et imagez les embryons avec un stéréomicroscope (champ lumineux et canaux fluorescents respectifs) (Figure 5A,B,D,F).REMARQUE: Si vous utilisez le stéréomicroscope à fluorescence Leica M165 FC, utilisez un grossissement de 25x pour obtenir des images avec une bonne résolution. Quantifier/analyser l’intensité du signal fluorescent par ImageJ (NIH). Utilisez l’outil Freehand Selection dans ImageJ pour quantifier le signal dans la région d’intérêt.