ניטור תגובות איתות ממוקדות בדגי זברה זחלים - Z-REX חושף מנגנונים מדויקים של תרופות אלקטרופיליות ומטבוליטים

הליכי גידול וטיפול בדגי זברה באוניברסיטת קורנל (ארצות הברית) בוצעו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). הליכי גידול וטיפול בדגי זברה ביחידת דגי הזברה של המכון הפדרלי השוויצרי לטכנולוגיה לוזאן (EPFL, שוויץ) בוצעו בעקבות חוק רווחת בעלי חיים SR 455 ופקודת רווחת בעלי חיים SR 455.1, עם אישור וטרינרי קנטונלי VD-H23. הערה: בפרוטוקול זה, קווי דגים Tg (lyz:TagRFP) ו-Tg (mpeg1:EGFP) המבטאים Halo-TeV-Keap1 משמשים להדגמת Z-REX. ניתן להרחיב את השיטה לחלבונים אחרים בעלי עניין, קווי דגים של כתבים טרנסגניים ובדיקות ביולוגיות במורד הזרם. עיין בטבלה משלימה 1 עבור המאגרים ששימשו במחקר זה. כל הריאגנטים, המכשירים, הציוד, הנוגדנים, הפלסמידים, זני דגי הזברה והציוד מפורטים בטבלת החומרים. 1. הכנת mRNA הכן את Halo-TeV-Keap1-2xHA ואת Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA mRNA באמצעות ערכת התמלול mMessage mMachine SP6 in vitro .הערה: בצע את הוראות היצרן ובצע תגובות בקנה מידה של 40 μL עבור כל mRNA. להמיס מחדש את גלולת ה-mRNA ב-10 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז. להעריך את איכות mRNA ולמדוד את הריכוז על ידי ספקטרופוטומטר microvolume ואלקטרופורזה ג’ל agarose. mRNA באיכות טובה צריך להיות יחס A260/A280 של סביב או מעל 2.0. לדלל את ה-mRNA ל-1-1.5 מ”ג/מ”ל במים נטולי נוקלאז. Aliquot תמיסת mRNA (1-2 μL לכל צינור), ולאחסן את aliquots ב -80 ° C. 2. ייצור עוברי דגים אפשרות 1: ייצור עוברי דגים מסוג בר (WT).הציבו 10 זוגות דגים ב-10 מכלים נפרדים, כאשר כל מכל מכיל מחיצה בין דג האב הזכר לנקבה.הערה: סך של 10 זוגות חוצים מספק בדרך כלל מספר מספיק של עוברים לבדיקה. ניתן לכוונן את מספר זוגות ההצלבה בהתאם לתכנון/צורך הניסוי ולפוריות של דגי ההורה. למחרת בבוקר, לאחר התקנת המזרק, הסירו את המחיצות בחמישה מהמכלים. המתן 30 דקות עד שהדג יזדווג. העבירו את דג האב למכל אחר, אספו עוברים על ידי העברת מי המיכל דרך מסננת, ולאחר מכן שטפו את העוברים מהמסננת לצלחת פטרי בקוטר 10 ס”מ. עוברים אלה ישמשו לסבב הראשון של הזריקות.הערה: אם איכות הביציות מאצווה מסוימת ירודה (למשל, הביציות אטומות עקב הצטברות חלבונים), אל תאגרו אותן עם העוברים האחרים. (אופציונלי) בצע הליכים דומים כמתואר בשלבים 2.1.2-2.1.3 בחמשת המכלים האחרים לסבב ההזרקה הבא.הערה: עדיף לבצע רק סבב אחד של הזרקה, כדי למזער את הפרש הגילאים בין העוברים. עם זאת, אם נדרשים יותר עוברים ממה שניתן להזריק במנה אחת, מומלץ לבצע שני סבבי הזרקה כדי להבטיח שהעוברים יישארו בשלב של 1-4 תאים במהלך הזרקת mRNA. ניתן להתאים את מספר סבבי ההזרקה בהתאם למיומנות ההזרקה של המפעיל ולתכנון הניסוי. עם זאת, מומלץ לבצע את כל ההליך (מהסרת המחיצה הראשונה ועד הזרקת העובר האחרון) תוך שעתיים. הפרש גילאים גדול בין עוברים עלול לפגוע באמינות וביכולת השחזור של תוצאות הניסוי. אפשרות 2: ייצור עוברי דגים הטרוזיגוטיים טרנסגניים מסוג נויטרופילים/מקרופאגים.הגדירו 10 זוגות דגים חוצים ב-10 מכלים נפרדים, כאשר כל מכל מוכנס עם מחיצה בין דגי הורה זכרים ונקבות: דגי WT לעומת Tg( lyz:TagRFP), או דגי WT לעומת Tg(mpeg1:eGFP).הערה: הימנע מהצלבות בין דגים טרנסגניים הטרוזיגוטיים, שעלולים להשפיע על קריאות פלואורסצנטיות במורד הזרם, מכיוון שדגי כתב הומוזיגוטיים מראים אות פלואורסצנטי גבוה יותר בהשוואה לדגים הטרוזיגוטיים. קווי כתב טרנסגניים ועוברי WT ניתן להבחין בקלות בעת הדמיה. קיום תערובת של עוברים WT והטרוזיגוטים באותו מאגר אינו מהווה בעיה. lyz:TagRFP מדווח על נויטרופילים, ו-mpeg:eGFP מדווח על מקרופאגים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על שורות דגים אחרות של כתבים. בצע את שלבים 2.1.2-2.1.4. 3. הגדרת מיקרו-מזרק הפעל את מקור האוויר, הגדר את הלחץ האחורי ל- 0.2-0.5 psi והגדר את לחץ ההזרקה ל- 25-30 psi. טווח הלחץ הספציפי המוצג מומלץ בדרך כלל.הערה: חיוני שיהיה לחץ גב יציב כדי למנוע זרימה חוזרת של מדיה של דגים לתוך המחט. בעת כיול נפח ההזרקה בשלב 3.8, יש לשנות רק את זמן ההזרקה. אין לשנות את לחץ ההזרקה בשלבים הבאים; לחץ הזרקה נמוך עלול להוביל לכישלון הזרקה עקב מתח פני השטח והפנים, בעוד לחץ הזרקה גבוה עלול לפגוע בעוברים. נקה את הציוד ואת פלטפורמת ההזרקה עם פתרון טיהור RNase.הערה: RNase, אשר מפרק mRNA, יכול להגיע מהמפעיל או מהציוד. יש צורך לבצע את הניקוי לפני הניסוי, וללבוש כפפות. (אופציונלי) אם מזריקים יחד mRNA ומורפולינו, מערבבים מראש את השניים בצינור של 0.2 מ”ל.הערה: Z-REX פועל היטב באמצעות תמיסת ה-mRNA Halo-TeV-Keap1-2xHA בריכוז של 250-1500 ננוגרם/מיקרוליטר. מספר מורפולינואים שימשו גם בדגי זברה, ודווח על ריכוזים אופטימליים7. אם משתמשים במורפולינו עם רצף שלא פורסם, על המפעיל להעריך תחילה את הרעילות ואת יעילות פירוק הגנים של המורפולינו לפני השימוש בו ב- Z-REX. מעבירים 1-2 μL של mRNA (ו/או מורפולינו במידת הצורך7) למחט הזרקה עם קצה פיפטה מיקרו-מעמיס.הערה: אם מכינים מחטים עם מושך מיקרופיפטה Flaming/Brown, ההתקנה היא כדלקמן. חום: 520 יחידות; כוח משיכה: 60 יחידות; מהירות: 70 יחידות; עיכוב: 155 יחידות; לחץ: 550 יחידות; רמפה: 530 יחידות. התקן את המחט על מניפולטור microinjection.הערה: לחץ אחורי ממקור האוויר אמור לדחוף את תמיסת mRNA (/morpholino) לקצה המחט. השתמש במלקחיים חדים או סכין גילוח כדי לשבור את קצה המחט, וליצור פתח מתאים להזרקה. השקיעו את קצה המחט בשמן מינרלי על מיקרומטר שלב. יש להפעיל שתיים או שלוש פעימות הזרקה כדי להסיר בועות אוויר בקצה. כייל את גודל הטיפה ל- 2 nL על ידי שינוי זמן ההזרקה.הערה: זה מבוצע בצורה הטובה ביותר על ידי הזרקה לתוך שמן מינרלי (אשר מחקה את צמיגות שק החלמון) מונח על המוציטומטר. באמצעות מיקרוסקופ, השתמש בקווי הרשת של ההמוציטומטר כדי להעריך את גודל הטיפה שנוצרה במהלך ההזרקה, ולהתאים את זמן ההזרקה בהתאם. למרות שלעתים משתמשים בצבע אדום פנול, הצורך בו בהליך הזרקת mRNA המתואר כאן לא נצפתה. 4. מיקרו-הזרקה ממלאים צלחת הזרקה בתווך 10% תמיסת מלח מאוזנת טרייה של האנק (HBSS), ומיישרים את העוברים בחריצי הצלחת במלקחיים קהים.הערה: צלחת ההזרקה מוכנה עם 2% אגרוז ב 10% HBSS בינוני; החריצים נוצרים באמצעות תבנית פלסטיק. יש לטבול את קצה המחט בתווך HBSS 10% בצלחת ההזרקה. יש להפעיל שתיים או שלוש פעימות הזרקה כדי להסיר בועות אוויר בקצה. בכל זריקה חודרים לכוריון ולשק החלמון בתנועה אחת ומדביקים פולס הזרקה. נוזל מוזרק זה ניתן לראות מיד לאחר ההזרקה כספרואיד קטן בתוך שק החלמון. ספרואיד קטן זה מתפוגג במהירות יחסית. חזור על שלב זה עבור עוברים אחרים, עד לקבלת מספר מספיק של עוברים מוזרקים.הערה: שיעור ההישרדות של עוברים (הן מוזרקים והן לא מוזרקים) נע בדרך כלל בין 50%-90%. המטרה היא להזריק מספר כפול של עוברים הדרושים לכל קבוצת ביקורת/ניסוי. בבדיקת משיכת ביוטין, נדרשים 100-140 עוברים ברי קיימא לכל מצב. בבדיקת qRT-PCR, חמישה עוברים ברי קיימא מומלצים לכל מצב. גודל הדגימה עבור הדמיית דגים חיים ובדיקת צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה מוגדר על-ידי המשתמש; מומלץ שיהיו לפחות 20 עוברים ברי קיימא בכל מצב כדי להניב כוח סטטיסטי טוב בניתוח. שטפו את העוברים המוזרקים לצלחת פטרי חדשה בקוטר 10 ס”מ המכילה מדיה טרייה של 10% HBSS.הערה: ניתן לשטוף את העוברים בקלות מהחריצים באמצעות בקבוק שפריץ. אגרו את העוברים שלא הוזרקו לצלחת אחרת.הערה: העוברים שאינם מוזרקים יכולים לשמש כבקרות איכות לבריאות הדג, ביטוי חלבון בסיסי, רמות פלואורסצנטיות רקע וכו ‘, לפי הצורך. אם הליך ההזרקה עבד היטב, והזרקת mRNA/מורפולינו אינה קטלנית לעוברים, עוברים מוזרקים ולא מוזרקים צריכים להיות בעלי כדאיות דומה. 5. Z-REX יש לפזר את העוברים המוזרקים לכלים בקוטר 10 ס”מ, בהתאם למערך הניסוי (כלומר, מספר קבוצות הביקורת/ניסוי). בחדר חשוך עם תאורת אור אדום, החלף את המדיה ב- 30 מ”ל של 10% HBSS עם או בלי 1 מיקרומטר Ht-PreHNE (אלקין).הערה: Ht-PreHNE (אלקין) היא תרכובת בהירה. עוברים צריכים להישמר בחושך בשלבים הבאים. לדגור על העוברים ב 28.5 מעלות צלזיוס בחושך. ב 30.5 hpf, בחדר חשוך, להחליף את המדיה עם 30 מ”ל טרי של 10% HBSS.הערה: בעת החלפת המדיום, הסר כמה שיותר מהמדיום הישן. זה קריטי להסרת כמות לא קשורה / עודפת של Ht-PreHNE (אלקין) מן העוברים. לדגור על העוברים ב 28.5 ° C בחושך במשך 30 דקות. חזור על שלבים 5.4-5.5 פעמיים נוספות. הפעל את מנורת UV (365 ננומטר, 3 mW / cm2) למשך 5 דקות כדי לחמם מראש את המנורה.הערה: יש לבצע את שלב החימום המקדים של המנורה לפני שלב 5.8. עוצמת המנורה נמוכה יותר/לא יציבה בדקות הראשונות לאחר הפעלתה. עוצמת המנורה צריכה להימדד על ידי מד UV באופן קבוע. ב 32 hpf, לחשוף את העוברים לאור UV.אפשרות 1: עבור קריאות במורד הזרם, כגון הדמיית דגים חיים, צביעה אימונופלואורסצנטית בהר שלם, ניתוח פלואורסצנטי בג’ל (צימוד קליקים עם Cy5 azide), RNA-seq או qRT-PCR, חשוף את העוברים לאור UV במשך 3 דקות, מערבל את הלוחות כל 30 שניות. אפשרות 2: לקריאות במורד הזרם, כגון בדיקת משיכת ביוטין, חשוף את העוברים לאור UV למשך 5 דקות לכל היותר (ומינימום 3 דקות), ערבל את הצלחות כל 30 שניות, וצנן את הצלחות על קרח במשך דקה אחת.הערה: אם משתמשים בבדיקות שונות, יש למטב את זמן החשיפה לאור, בהתאם ל-t1/2 של דיקור עבור בדיקה אלקטרופילית בכלוב פוטו-כלוב נתון ומקור אור שנפרס. T1/2photouncaging ניתן לקבוע באמצעות הליכים ידועים8. עבור Ht-PreHNE (אלקין), t1/2 הוא < 1 דקות3; לפיכך, הזמן המצוין לעיל מספיק. 6. מבחני במורד הזרם אפשרות 1: בדיקה פנוטיפית. הדמיה חיה של כתב נויטרופילים/מקרופאגים טרנסגנייםקווי דגים, Tg (lyz:TagRFP) ו-Tg (mpeg1:eGFP) (איור 2)מרדימים את העוברים על ידי דגירה ב 4 ° C במשך 10 דקות.הערה: מומלץ שיהיו לפחות 20 עוברים ברי קיימא בכל מצב. הוציאו את העוברים הלא מופרים/מתים מהצלחת.הערה: העוברים הלא מופרים/מתים הם עכורים/לא שקופים, וניתן לזהותם באופן חזותי. אם נראה שיעור תמותה גבוה, חזור להליך ההזרקה או נסה להפחית את ריכוז mRNA או מורפולינו. Dechorionate את העוברים עם מלקחיים חדים. החזיקו את הכוריון עם זוג מלקחיים אחד, מבלי לגעת בדגי הזחל, והשתמשו בזוג המלקחיים השני כדי לקרוע את הכוריון. העובר שביר. גע בכוריון רק בעת ביצוע דכוריון.הערה: זה נפוץ, במיוחד אצל מתחילים, לפגוע בעוברים מסוימים במהלך dechorionation. לכן, תמיד יש יותר עוברים מהמינימום הדרוש. הרכיבו את העוברים על צלחת אגרוז 2% (שהוכנה עם 10% HBSS בינוני) ודמיינו את העוברים באמצעות סטריאומיקרוסקופ (שדה בהיר ותעלות פלואורסצנטיות בהתאמה) (איור 2A, C, G).הערה: לאחר Z-REX [שילוב של הזרקת mRNA Halo-TeV-Keap1-2xHA וטיפול ב-Ht-PreHNE (אלקין)], דלדול הנויטרופילים (lyz:TagRFP) נמצא כמשמעותי ביותר ב-36 HPF (4 שעות לאחר Z-REX), בעוד שההפחתה של המקרופאגים (mpeg1:eGFP) הייתה המשמעותית ביותר ב-34 HPF (שעתיים לאחר Z-REX) (איור 2E,F). ניתן להשתמש בנקודות זמן אחרות אם משתמשים בקווי כתב שונים, mRNA/מורפולינו או גשושיות. זמן החשיפה ו/או הרווח חייבים להיות אופטימליים להדמיה של תאים בודדים או המבנים הספציפיים (אולטרה) הרצויים. ספרו את מספר הנויטרופילים/המקרופאגים של כל דג לפי ImageJ (NIH) (איור 2B, D-F, H). השתמשו בכלי בחירה חופשית ב-ImageJ כדי להקיף את הדג כולו, והשתמשו באפשרות Find Maxima כדי לספור את התאים הפלואורסצנטיים. אפשרות 2: הערכת תיוג יעדים. צימוד ביוטין אזיד-קליק ובדיקת ביוטין נפתחת (תרשים 3)מרדימים את העוברים על ידי דגירה ב 4 ° C. פעולה זו נמשכת בדרך כלל 10 דקות.הערה: כדי להשיג מספיק ליזט דגים, נדרשים 100-140 עוברים ברי קיימא לכל מצב. הוציאו את העוברים הלא מופרים/מתים מהצלחת. בצע dechorionation ו deyolking. בצעו את שתי המניפולציות על ידי החזקת הכוריון עם זוג מלקחיים חדים, שימוש בזוג המלקחיים השני כדי לחדור לשק החלמון, ולאחר מכן הפרדת שק החלמון תוך הסרת הכוריון כדי לאפשר לחלבוני החלמון לצאת.הערה: קריטי להסיר את חלבוני החלמון בשלב זה. חלבוני החלמון השופעים בדגימה מפריעים לניתוח מאוחר יותר. מעבירים את העוברים החלמונים לתוך צינור של 1.5 מ”ל.הערה: מערבלים את הצלחת כדי למרכז את העוברים החלמונים, מה שמקל על האיסוף. פסולת הכוריון הקלה יותר מתפוגגת במהלך תהליך זה. לאחר שהעוברים מתיישבים לתחתית הצינור, הסירו את הסופרנטנט והוסיפו 1 מ”ל של מלח חצוי HEPES צונן (pH 7.6). חזור על שלב 6.2.5 פעמיים נוספות. (אופציונלי) אם אינך מתכוון להמשיך לשלב הבא באופן מיידי, הסר את החיץ, הקפיא במהירות הבזק את הדגימות בחנקן נוזלי ואחסן אותן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.הערה: כדורי דגים חלמונים ניתנים להקפאה מהירה בחנקן נוזלי ומאוחסנים בטמפרטורה של -80°C. דגימות הבזק קפואות ניתן לאחסן ב -80 ° C עד שבועיים. משעים מחדש את כדורי הדג בחיץ ליזיס.הערה: חיץ ליזיס (pH 7.6) מורכב מ-50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.3 mM TCEP, 2x מעכבי פרוטאז נטולי Roche cOmplete Mini EDTA, ומעכב טריפסין 0.1 מ”ג/מ”ל מפולי סויה. עובר אחד נותן בערך 2 מיקרוגרם של ליזט. השתמש 100 μL של חיץ ליזה עבור כל 120 עוברים. יש להוסיף שני מעכבי פרוטאז ללא EDTA של Roche cOmplete Mini ומעכבי טריפסין מפולי סויה למאגר הליזה ממש לפני השימוש. הוסף 20% חרוזי זירקוניה v/v לצינור. מערבולת במשך 20 שניות, להקפיא הבזק בחנקן נוזלי, ולהפשיר באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. חזור על שלב 6.2.10 פעמיים נוספות. צנטריפוגה את התמיסה ב 21,000 x גרם ב 4 ° C במשך 10 דקות. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חדש בנפח 1.5 מ”ל. למדוד את ריכוז החלבון על ידי בדיקת ברדפורד. לדלל את הליזט ל 1 מ”ג / מ”ל. עבור כל מצב, להעביר 170 מיקרוגרם של ליזט לתוך צינור 2 מ”ל. ערבבו את הליזט משלב 6.2.16 עם פרוטאז TeV במינון 0.2 מ”ג/מ”ל (S219V), ודגרו על התמיסה בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.הערה: עבור קבוצות שאינן מטופלות בפרוטאז TeV, פשוט ערבבו את הליזט עם חיץ ליזה שווה לתמיסת פרוטאז TeV המשמשת בקבוצות אחרות. הכינו תערובת מאסטר 10x לתגובת קליק ביוטין-אזיד: 10% עם SDS, 10 mM CuSO4, 1 mM Cu(TBTA), 1 mM ביוטין-אזיד ו-20 mM TCEP.הערה: הוסף TCEP לתערובת ממש לפני שלב 6.2.19. הוסף 8.5 μL של t-BuOH ו- 17 μL של תערובת מאסטר תגובת לחיצה 10x לליזט (TeV מעוכל פרוטאז) משלב 6.2.17. מערבול, צנטריפוגה, לדגור את התמיסה ב 37 ° C במשך 15 דקות. הוסף עוד 1 mM TCEP לתמיסה, ולאחר מכן מערבול, צנטריפוגה, ודגר על התמיסה ב 37 ° C במשך 15 דקות נוספות. זמן הדגירה של שלבים 6.2.19-6.2.20 הוא 30 דקות בסך הכל.הערה: תוספת זו של TCEP, מגיב מקטין ליצירת Cu(I), משפרת את יעילות תגובת הלחיצה. הוסף 600 μL של -20 ° C אתנול לכל צינור, מערבל את התמיסה, ולדגור אותו ב -80 ° C במשך הלילה.הערה: ניתן לאחסן את הדגימות ב -80 °C למשך שבוע אחד; אם לא, המשך לשלב הבא באופן מיידי. צנטריפוגה התמיסה ב 21,000 x גרם ב 4 ° C במשך 1 שעות.הערה: גלולה צריכה להיווצר בתחתית הצינור לאחר צנטריפוגה, שהוא החלק הרצוי. הסר את supernatant, להוסיף 1 מ”ל של -20 ° C אתנול, מערבולת, וצנטריפוגה את התמיסה ב 21,000 x גרם ב 4 ° C במשך 10 דקות. חזור על שלב 6.2.23. הסר את supernatant, להוסיף 1 מ”ל של -20 ° C אצטון, מערבולת, וצנטריפוגה את התמיסה ב 21,000 x גרם ב 4 ° C במשך 10 דקות. הסר את supernatant. יש לאפשר לשאריות אצטון עודפות להתאדות, אם כי לא ליובש מלא. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-100 μL של חיץ השעיה (8% w/v ליתיום דודציל סולפט [LDS], 1 mM EDTA ב-50 mM HEPES מלוחים, pH 7.6), מערבולת למשך 15 שניות, וסוניקט עד להמסת הכדורית. צנטריפוגה את התמיסה ב 21,000 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חדש של 2 מ”ל, ומוסיפים 1.5 מ”ל של מי מלח HEPES 50 מ”מ, pH 7.6.הערה: הריכוז הסופי של LDS בשלב זה הוא 0.5%. ריכוזי LDS גבוהים יותר עלולים לפגוע ביעילות המשיכה. לכן, למרות שהגדלת ריכוז LDS יכולה לסייע בהפחתת קשירה לא ספציפית, היא עשויה גם להפחית את יעילות המשיכה. לפיכך, מומלץ לא לשנות את ריכוז LDS בשלב זה. אספו את דגימת ה”קלט” (איור 3): העבירו 30 מיקרוליטר של 1 מ”ג/מ”ל ליזט לצינור חדש של 1.5 מ”ל, והוסיפו 10 מיקרוליטר של מאגר דגימת 4x Laemmli המכיל 6% β-מרקפטואתנול (BME). הבזק להקפיא את הפתרון, ולאחסן אותו ב -80 ° C. העבר 100 μL של שרף סטרפטאבידין בנפח מיטה בקיבולת גבוהה לצינור חדש של 2 מ”ל. הוסף 1 מ”ל של 0.5% LDS במי מלח HEPES של 50 מ”מ (pH 7.6), צנטריפוגה ב- 1,500 x גרם ב- RT למשך 2 דקות, והסר את הסופרנטנט. חזור על הכביסה עם עוד 1 מ”ל של 0.5% LDS ב 50 mM HEPES מלוחים (pH 7.6). העבירו את התמיסה משלב 6.2.29 לצינור המכיל שרף סטרפטאווידין בעל קיבולת גבוהה שנשטף מראש משלב 6.2.31, ודגרו על התמיסה במיקסר מקצה לקצה ב- RT למשך 4-6 שעות. צנטריפוגו את התערובת ב 1,500 x גרם ב RT במשך 2 דקות, לקחת 30 μL של supernatant, ולערבב אותו עם 10 μL של 4x מאגר דגימת Laemmli המכיל 6% BME עבור הדגימה “flowthrough”. לאחר מכן, הסר את הסופרנאטנט שנותר.הערה: ניתן לנתח דגימות “זרימה” על ידי כתם מערבי כדי לבדוק את יעילות משיכת הסטרפטאווידין כלפי מטה. חיוני להסיר כמה שיותר מהסופרנאטנט כדי לשטוף את החלבונים הבלתי קשורים. ראשית, הסר את רוב הסופרנאטנט באמצעות פיפטה P-1000, ולאחר מכן הסר את הסופרנאטנט הנותר באמצעות פיפטה P-20 עם קצה העמסת ג’ל. הוסיפו 1 מ”ל של 0.5% LDS במי מלח HEPES של 50 מ”מ (pH 7.6) לשרף, ודגרו על התערובת במשך 30 דקות ב-RT עם סיבוב מקצה לקצה. צנטריפוגו את התערובת ב 1,500 x גרם ב RT במשך 2 דקות, ולהסיר את supernatant.הערה: בדרך כלל, 0.5% LDS מספיק להסרת רוב חלבוני הקישור שאינם ספציפיים. אם אותות קשירה לא ספציפיים עדיין נראים בניתוח מאוחר יותר, ניתן להגדיל את ריכוז LDS במאגר הכביסה. חזור על שלב 6.2.34-6.2.35 פעמיים נוספות. הוסף 40 μL של חיץ דגימה 2x Laemmli המכיל 6% BME לשרף. יש להאיר את החלבונים הקשורים על ידי דגירה על התערובת בטמפרטורה של 98°C למשך 5 דקות. צנטריפוגו את התערובת במהירות של 21,000 x גרם ב-RT למשך 5 דקות, והעבירו את הסופרנאטנט לצינור חדש של 1.5 מ”ל. זהו מדגם “elute”.הערה: טעינה ישירה של תמיסה המכילה שרף משלב 6.2.38 לתוך הג’ל עשויה להשפיע על ניתוח SDS-PAGE. יש להעמיס 20 μL לכל באר של ג’ל 10% פוליאקרילאמיד בעל 10 נתיבים, ולהפעיל אלקטרופורזה בג’ל.הערה: הפעל את הג’ל במתח נמוך יותר (120 V) עד שחזית הצבע תגיע לג’ל הפתרון, ושנה את המתח ל- 170 V. עצור את התוכנית לאחר שחזית הצבע יוצאת. בצעו הדבקה מערבית עם נוגדנים נגד HA, אנטי-הילה או נוגדנים אחרים המזהים חלבוני משק בית (איור 3). אפשרות 3: ניתוח תמלול. RNA-seq ו-qRT-PCR (איור 4)הערה: מומלץ מאוד להשתמש בעוברים שהונחו בהפרש של 15 דקות זה מזה לבדיקה זו. הפרש הגילאים של העוברים משפיע באופן משמעותי על תוצאות הבדיקה.מרדימים את העוברים על ידי דגירה שלהם ב 4 ° C במשך 10 דקות, 2 שעות לאחר Z-REX. בצע dechorionation עם מלקחיים חדים (שלב 6.1.3). (אופציונלי) בצע סגמנטציה עם מלקחיים (למשל, להפריד את הראש מהזנב) אם יש לנתח מקטעים שונים בנפרד. אם מוציאים RNA מעובר שלם, מעבירים שלושה עד חמישה עוברים לצינור של 1.5 מ”ל. אם מחלצים RNA מהראש או מהזנב, מעבירים 10-12 מקטעים חתוכים לצינור של 1.5 מ”ל.הערה: מומלץ לבצע את הניסוי עם שלושה עד חמישה שכפולים ביולוגיים. הוסף 1 מ”ל של מגיב TRIzol וחרוזי זכוכית לצינור.הערה: נמצא כי חרוזי זכוכית עובדים טוב יותר מחרוזי זירקוניה למיצוי RNA. מערבבים את התערובת במשך 30 שניות.הערה: אם לא ממשיכים לשלב הבא באופן מיידי, ניתן לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של -80°C למשך 1-3 שבועות. חלצו את הרנ”א בהתאם להוראות היצרן. להעריך את האיכות והריכוז של הרנ”א על ידי ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח ואלקטרופורזה של ג’ל אגרוז.הערה: RNA באיכות טובה צריך להיות יחס A260/A280 של סביב או מעל 2.0. או להגיש את הרנ”א לריצוף, או לטפל ב-1 מיקרוגרם של RNA עם DNase I בדרגת הגברה, ולבצע תעתיק הפוך באמצעות כתב עילי III שעתוק הפוך ואוליגו-(dT)20. בצע שלב זה בהתאם להוראות היצרן. בצעו qRT-PCR ונתחו את הנתונים בשיטת ΔΔCT9 (איור 4B-D). אפשרות 4: ביטוי POI וניתוח לוקליזציה. בדיקת צביעה אימונופלואורסצנטית בהר שלם (איור 5)הערה: עוברים קבועים בפורמלדהיד הם שבירים. הימנעו מטלטול נמרץ, וטפלו בזהירות.Dechorionate את העוברים על ידי ביצוע שלבים 6.1.1-6.1.3. מעבירים את העוברים לצינור של 1.5 מ”ל.הערה: בכל צינור צריך להיות מספר שווה של עוברים, ולא יותר מ-40 עוברים. לאחר שהעוברים מתיישבים לתחתית הצינור, הסירו את הסופרנטנט והוסיפו 1 מ”ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) (pH 7.6). חזור על שלב 6.4.3 פעם נוספת. הסר את הסופרנטנט, הוסף 1 מ”ל של פורמלדהיד 4% ב- PBS (pH 7.6), ודגר על הצינור ב- 4 ° C למשך הלילה עם נדנוד עדין.הערה: הדגימות בתמיסת פורמלדהיד ניתן לאחסן ב 4 ° C במשך שבוע אחד. הסר את supernatant, להוסיף 1 מ”ל של -20 ° C מתנול, לדגור את הצינור על הצד שלה ב -20 ° C במשך לפחות 18 שעות.הערה: ניתן לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של -20°C למשך חודש אחד או יותר. הסר את הסופרנטנט והוסף 1 מ”ל של מאגר PDT (0.3% v/v Triton X-100, 0.1% v/v Tween-20 ו-1% v/v dimethyl sulfoxide [DMSO] במאגר PBS). חזור על שלב 6.4.7, ודגר על הצינור ב- RT במשך 30 דקות עם נדנוד עדין. הסר את הסופרנטנט, הוסף 1 מ”ל של חיץ חוסם (10% v/v סרום בקר עוברי מומת בחום [FBS], 2% אלבומין בסרום בקר [BSA], ו- 0.1% v/v Tween-20 במאגר PBS), ודגור על הצינור ב- RT למשך שעה אחת עם נדנוד עדין. הסר את supernatant, ולהוסיף 200 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית (מדולל במאגר חוסם). הסר את הסופרנטנט, הוסף 500 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית (מדולל בחיץ חוסם), ודגר על הצינור ב -4 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם נדנוד עדין.הערה: אם משתמשים בנוגדן ראשוני חדש, כדאי לכלול כמה דגימות ללא צביעת נוגדנים ראשונית שישמשו כבקרות שליליות. עם זאת, באופן אידיאלי, עוברים מורפולינו או עוברים מהונדסים גנטיים, או עוברים שבהם ביטוי של חלבון המטרה עורר, הם אמצעים אמינים יותר לאמת את הנוגדן. הסר את הסופרנטנט, הוסף 1 מ”ל של חיץ PDT, ודגר על הצינור ב- RT למשך 30 דקות עם נדנוד עדין. חזור על שלב 6.4.12. הסר את supernatant, להוסיף 1 מ”ל של חיץ חוסם, לדגור את הצינור ב RT במשך 1 שעה עם נדנוד עדין.הערה: הדגימות צריכות להיות מוגנות מפני אור לאחר שלב זה, כדי למנוע הלבנה של הפלואורופור המצומד על הנוגדן המשני. הסר את supernatant, ולהוסיף 200 μL של תמיסת נוגדנים משנית (מדולל במאגר חוסם). הסר את הסופרנטנט, הוסף 500 μL של תמיסת נוגדנים משנית (מדוללת בחיץ חוסם), ודגר על הצינור ב- RT למשך 1.5 שעות עם נדנוד עדין. הסר את הסופרנטנט, הוסף 1 מ”ל של חיץ PDT, ודגר על הצינור ב- RT למשך 30 דקות עם נדנוד עדין. חזור על שלב 6.4.17. הרכיבו את העוברים על לוחית אגרוז 2% (עשויה PBS, pH 7.6) ודמיינו את העוברים באמצעות סטריאומיקרוסקופ (שדה בהיר ותעלות פלואורסצנטיות מתאימות) (איור 5A,B,D,F).הערה: אם אתה משתמש בסטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי Leica M165 FC, השתמש בהגדלה של פי 25 כדי לקבל תמונות ברזולוציה טובה. כמת/נתח את עוצמת האות הפלואורסצנטי על ידי ImageJ (NIH). השתמש בכלי בחירה חופשית ב- ImageJ כדי לכמת את האות באזור העניין.