Monitoring van on-target signaalreacties bij larvale zebravissen - Z-REX ontmaskert precieze mechanismen van elektrofiele geneesmiddelen en metabolieten

Zebravishouderij- en behandelingsprocedures aan de Cornell University (Verenigde Staten) werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health (NIH) en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Zebravishouderij en behandelingsprocedures bij de zebraviseenheid van het Zwitserse Federale Instituut voor Technologie Lausanne (EPFL, Zwitserland) werden uitgevoerd volgens de Animal Welfare Act SR 455 en Animal Welfare Ordinance SR 455.1, met kantonnale veterinaire toestemming VD-H23. OPMERKING: In dit protocol worden Tg( lyz:TagRFP ) en Tg(mpeg1:EGFP) vislijnen die Halo-TeV-Keap1 uitdrukken gebruikt om Z-REX te demonstreren. De methode kan worden uitgebreid naar andere interessante eiwitten, transgene reporter vislijnen en stroomafwaartse biologische assays. Zie aanvullende tabel 1 voor de buffers die in dit onderzoek zijn gebruikt. Alle reagentia, instrumenten, apparatuur, antilichamen, plasmiden, zebravisstammen en apparatuur zijn opgenomen in de materiaaltabel. 1. mRNA-preparaat Bereid Halo-TeV-Keap1-2xHA en Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA mRNA voor met behulp van de mMessage mMachine SP6 in vitro transcriptiekit.OPMERKING: Volg de instructies van de fabrikant en voer 40 μL schaalreacties uit voor elk mRNA. Los de mRNA-pellet opnieuw op in 10 μL nucleasevrij water. Beoordeel de mRNA-kwaliteit en meet de concentratie met behulp van microvolumespectrofotometer en agarosegel-elektroforese. Een mRNA van goede kwaliteit moet een A260/A280 verhouding hebben van rond of boven de 2,0. Verdun het mRNA tot 1-1,5 mg/ml met nucleasevrij water. Aliquot de mRNA-oplossing (1-2 μL per buis) en bewaar de aliquots bij -80 °C. 2. Productie van visembryo’s Optie 1: Het produceren van wild-type (WT) visembryo’s.Zet 10 viskruisende paren op in 10 afzonderlijke tanks, waarbij elke tank een scheidingswand bevat tussen de mannelijke en vrouwelijke oudervissen.OPMERKING: Een totaal van 10 kruisende paren levert doorgaans een voldoende aantal embryo’s op voor de assays. Het aantal kruisingsparen kan worden aangepast aan de ontwerp/behoefte van het experiment en de vruchtbaarheid van de oudervissen. De volgende ochtend, na het instellen van de injector, verwijdert u de verdelers in vijf van de tanks. Wacht 30 minuten tot de vis paart. Verplaats de oudervis naar een andere tank, verzamel embryo’s door het tankwater door een zeef te laten gaan en spoel de embryo’s vervolgens uit de zeef in een petrischaal van 10 cm. Deze embryo’s zullen worden gebruikt voor de eerste injectieronde.OPMERKING: Als de eikwaliteit van een bepaalde batch slecht is (bijv. Eieren zijn ondoorzichtig als gevolg van aggregatie van eiwitten), voeg ze dan niet samen met de andere embryo’s. (Optioneel) Voer soortgelijke procedures uit zoals beschreven in stap 2.1.2-2.1.3 op de andere vijf tanks voor de volgende injectieronde.OPMERKING: Het is het beste om slechts één injectieronde uit te voeren om het leeftijdsverschil tussen embryo’s te minimaliseren. Als er echter meer embryo’s nodig zijn dan in één partij kunnen worden geïnjecteerd, wordt het uitvoeren van twee injectierondes aanbevolen om ervoor te zorgen dat de embryo’s tijdens de mRNA-injectie in een 1-4-celstadium blijven. Het aantal injectierondes kan worden aangepast aan de injectievaardigheid en het experimentontwerp van de operator. Er wordt echter voorgesteld om de hele procedure (van het verwijderen van de eerste verdeler tot de injectie van het laatste embryo) binnen 2 uur uit te voeren. Een groot leeftijdsverschil tussen embryo’s kan de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de experimentresultaten aantasten. Optie 2: Het produceren van heterozygote transgene neutrofielen/macrofaag reporter visembryo’s.Zet 10 viskruisingsparen op in 10 afzonderlijke tanks, waarbij elke tank wordt ingevoegd met een scheidingswand tussen mannelijke en vrouwelijke oudervissen: WT-vis versus Tg (lyz: TagRFP) of WT-vis versus Tg (mpeg1: eGFP).OPMERKING: Vermijd in-kruisingen tussen heterozygote transgene vissen, die stroomafwaarts fluorescerende uitlezingen kunnen beïnvloeden, omdat homozygote reportervissen een hoger fluorescerend signaal vertonen in vergelijking met heterozygote vissen. Transgene reporterlijnen en WT-embryo’s kunnen gemakkelijk worden onderscheiden bij beeldvorming. Het hebben van een mengsel van WT en heterozygote embryo’s in dezelfde pool is geen probleem. lyz:TagRFP rapporteert neutrofielen en mpeg:eGFP rapporteert macrofagen. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere reporter vislijnen. Volg de stappen 2.1.2-2.1.4. 3. Micro-injector instellen Schakel de luchtbron in, stel de tegendruk in op 0,2-0,5 psi en stel de injectiedruk in op 25-30 psi. Het specifieke drukbereik dat wordt weergegeven, wordt meestal aanbevolen.OPMERKING: Het is essentieel om een stabiele tegendruk te hebben om te voorkomen dat vismedia terugstromen in de naald. Bij het kalibreren van het injectievolume in stap 3.8 moet alleen de injectietijd worden gewijzigd. Verander de injectiedruk niet in de volgende stappen; Lage injectiedruk kan leiden tot injectiefalen als gevolg van oppervlakte- en interfaciale spanning, terwijl hoge injectiedruk embryo’s kan beschadigen. Reinig de apparatuur en het injectieplatform met de RNase-ontsmettingsoplossing.OPMERKING: RNase, dat mRNA afbreekt, kan afkomstig zijn van de operator of de apparatuur. Het is noodzakelijk om de schoonmaak vóór het experiment uit te voeren en handschoenen te dragen. (Optioneel) Als u mRNA en morfolino co-injecteert, mengt u de twee in een buis van 0,2 ml.OPMERKING: Z-REX werkt goed met behulp van Halo-TeV-Keap1-2xHA mRNA-oplossing met een concentratie van 250-1500 ng / μL. Verschillende morfolino’s zijn ook gebruikt in zebravissen en de optimale concentraties zijn gemeld7. Bij gebruik van een morfolino met een niet-gepubliceerde sequentie moet de operator eerst de toxiciteit en genafbraakefficiëntie van het morfolino beoordelen voordat het in Z-REX wordt gebruikt. Breng 1-2 μL mRNA (en/of morfolino indien van toepassing7) over in een injectienaald met een pipetpunt van de microlader.OPMERKING: Als u naalden bereidt met een Flaming/Brown micropipettrekker, is de opstelling als volgt. Warmte: 520 eenheden; trekkracht: 60 eenheden; snelheid: 70 eenheden; vertraging: 155 eenheden; druk: 550 eenheden; Oprit: 530 eenheden. Installeer de naald op de microinjectiemanipulator.OPMERKING: De tegendruk van de luchtbron moet de mRNA(/morpholino)-oplossing naar de naaldpunt duwen. Gebruik een scherpe tang of een scheermesje om de naaldpunt te breken, waardoor een geschikte opening voor injectie ontstaat. Dompel de naaldpunt onder in minerale olie op een podiummicrometer. Breng twee of drie injectiepulsen aan om luchtbellen in de punt te verwijderen. Kalibreer de druppelgrootte tot 2 nL door de injectietijd te wijzigen.OPMERKING: Dit kan het beste worden uitgevoerd door te injecteren in minerale olie (die de viscositeit van de dooierzak nabootst) die op een hemocytometer wordt gelegd. Gebruik met behulp van een microscoop de rasterlijnen van de hemocytometer om de grootte van de druppel die tijdens de injectie wordt gevormd te schatten en pas de injectietijd dienovereenkomstig aan. Hoewel fenolrode kleurstof soms wordt gebruikt, is de noodzaak ervan in de hier beschreven mRNA-injectieprocedure niet waargenomen. 4. Micro-injectie Vul een injectieplaat met vers 10% Hank’s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) medium en lijn de embryo’s in de groeven van de plaat uit met een stompe tang.OPMERKING: De injectieplaat wordt bereid met 2% agarose in 10% HBSS-medium; De groeven worden gevormd met behulp van een plastic mal. Dompel de naaldpunt onder in 10% HBSS-medium in de injectieplaat. Breng twee of drie injectiepulsen aan om luchtbellen in de punt te verwijderen. Prik voor elke injectie in één beweging door het chorion en de dooierzak en breng een injectiepuls aan. Deze geïnjecteerde vloeistof kan direct na de injectie worden gezien als een kleine sferoïde in de dooierzak. Deze kleine sferoïde verdwijnt relatief snel. Herhaal deze stap voor andere embryo’s, totdat een voldoende aantal geïnjecteerde embryo’s is verkregen.OPMERKING: De overlevingskans van embryo’s (zowel geïnjecteerd als niet-geïnjecteerd) varieert meestal van 50% -90%. Streef ernaar om het dubbele aantal embryo’s te injecteren dat nodig is voor elke controle/ experimentele groep. In de biotine pull-down assay zijn 100-140 levensvatbare embryo’s nodig voor elke aandoening. In de qRT-PCR-test worden vijf levensvatbare embryo’s aanbevolen voor elke aandoening. De steekproefgrootte voor beeldvorming van levende vissen en immunofluorescentiekleuringstest met hele montage is door de gebruiker gedefinieerd; Het hebben van ten minste 20 levensvatbare embryo’s per aandoening wordt aanbevolen om een goede statistische kracht in de analyse op te leveren. Spoel de geïnjecteerde embryo’s uit tot een nieuwe petrischaal van 10 cm met verse 10% HBSS-media.OPMERKING: De embryo’s kunnen gemakkelijk uit de groeven worden gespoeld met behulp van een spuitfles. Bundel de niet-geïnjecteerde embryo’s in een andere plaat.OPMERKING: De niet-geïnjecteerde embryo’s kunnen dienen als kwaliteitscontroles voor de gezondheid van de vis, baseline eiwitexpressie, achtergrondfluorescentieniveaus, enz., Indien nodig. Als de injectieprocedure goed werkte en geïnjecteerd mRNA/morfolino niet dodelijk is voor de embryo’s, moeten geïnjecteerde en niet-geïnjecteerde embryo’s een vergelijkbare levensvatbaarheid hebben. 5. Z-REX Verdeel de geïnjecteerde embryo’s in schalen van 10 cm, volgens de opstelling van het experiment (d.w.z. aantallen controle- / experimentgroepen). Vervang in een donkere kamer met roodlichtverlichting de media door 30 ml 10% HBSS met of zonder 1 μM Ht-PreHNE (alkyn).OPMERKING: Ht-PreHNE (alkyn) is een licht-labiele verbinding. Embryo’s moeten in de volgende stappen in het donker worden gehouden. Incubeer de embryo’s bij 28,5 °C in het donker. Vervang bij 30,5 hpf in een donkere kamer de media door een verse 30 ml 10% HBSS.OPMERKING: Verwijder bij het vervangen van het medium zoveel mogelijk van het oude medium. Dit is van cruciaal belang voor het verwijderen van de ongebonden/overtollige hoeveelheid Ht-PreHNE (alkyn) uit de embryo’s. Incubeer de embryo’s bij 28,5 °C in het donker gedurende 30 minuten. Herhaal stap 5.4-5.5 nog twee keer. Zet de UV-lamp (365 nm, 3 mW/cm2) gedurende 5 minuten aan om de lamp voor te verwarmen.OPMERKING: De voorverwarmingsstap van de lamp moet vóór stap 5.8 worden uitgevoerd. Het lampvermogen is lager/onstabiel in de eerste paar minuten nadat het is ingeschakeld. Het lampvermogen moet regelmatig worden gemeten door een UV-meter. Bij 32 hpf stellen de embryo’s bloot aan UV-licht.Optie 1: Voor stroomafwaartse uitlezingen, zoals beeldvorming van levende vissen, immunofluorescentiekleuring met hele montage, fluorescentieanalyse in de gel (klikkoppeling met Cy5-azide), RNA-seq of qRT-PCR, stelt u de embryo’s gedurende 3 minuten bloot aan UV-licht, waarbij de platen om de 30 s worden gedraaid. Optie 2: Voor stroomafwaartse uitlezingen, zoals biotine pull-down assay, stelt u de embryo’s maximaal 5 minuten (en minimaal 3 minuten) bloot aan UV-licht, draait u de platen om de 30 s en koelt u de platen gedurende 1 minuut op ijs.OPMERKING: Als u verschillende sondes gebruikt, moet de belichtingstijd van het licht worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de t1/2 van de foto-uncaging voor een bepaalde gefotografeerde elektrofiele sonde en lichtbron die wordt ingezet. t1/2fotouncaging kan worden bepaald met behulp van bekende procedures8. Voor Ht-PreHNE (alkyne) is t 1/2 < 1 min3; De hierboven aangegeven tijd is dus voldoende. 6. Downstream-assays Optie 1: Fenotypische assay. Live beeldvorming van transgene neutrofielen/macrofaag reportervislijnen, Tg(lyz:TagRFP) en Tg(mpeg1:eGFP) (Figuur 2)Verdoof de embryo’s door incubatie bij 4 °C gedurende 10 min.OPMERKING: Het wordt aanbevolen om ten minste 20 levensvatbare embryo’s per aandoening te hebben. Verwijder de onbevruchte/dode embryo’s van de plaat.OPMERKING: De onbevruchte/dode embryo’s zijn troebel/niet-transparant en kunnen visueel worden geïdentificeerd. Als een hoog sterftecijfer wordt gezien, controleer dan de injectieprocedure of probeer de concentratie van mRNA of morfolino te verminderen. Dechorioneer de embryo’s met een scherpe tang. Houd het chorion vast met één paar tangen, zonder de larvale vis aan te raken, en gebruik het andere paar tangen om het chorion af te scheuren. Het embryo is fragiel. Raak het chorion alleen aan bij het uitvoeren van dechorionatie.OPMERKING: Het is gebruikelijk, vooral bij beginners, om sommige embryo’s te beschadigen tijdens dechorionatie. Zorg daarom altijd voor meer embryo’s dan het minimaal benodigde embryo’s. Monteer de embryo’s op een 2% agarose plaat (bereid met 10% HBSS medium) en beeld de embryo’s af met een stereomicroscoop (helder veld en respectievelijke fluorescerende kanalen) (Figuur 2A, C, G).OPMERKING: Na Z-REX [combinatie van Halo-TeV-Keap1-2xHA mRNA-injectie en Ht-PreHNE(alkyne)-behandeling] bleek de depletie van neutrofielen (lyz:TagRFP) het meest significant te zijn bij 36 hpf (4 h na Z-REX), terwijl de reductie van macrofagen (mpeg1:eGFP) het meest significant was bij 34 hpf (2 h na Z-REX) (figuur 2E,F). Andere tijdstippen kunnen worden gebruikt als verschillende reporterlijnen, mRNA / morpholino of sondes worden gebruikt. De belichtingstijd en/of -versterking moet worden geoptimaliseerd voor het visualiseren van afzonderlijke cellen of de gewenste specifieke (ultra)structuren. Tel het neutrofielen/macrofaagnummer van elke vis door ImageJ (NIH) (Figuur 2B, D-F, H). Gebruik het gereedschap Selectie uit de vrije hand in ImageJ om de hele vis te omcirkelen en gebruik de optie Maxima zoeken om de fluorescerende cellen te tellen. Optie 2: Beoordeling van doeletikettering. Biotine azide-klikkoppeling en biotine pull-down assay (Figuur 3)Verdoof de embryo’s door incubatie bij 4 °C. Dit duurt meestal 10 min.OPMERKING: Om voldoende vislysaat te verkrijgen, zijn 100-140 levensvatbare embryo’s nodig voor elke aandoening. Verwijder de onbevruchte/dode embryo’s van de plaat. Voer dechorionatie en deyolking uit. Voer de twee manipulaties uit door het chorion vast te houden met een paar scherpe tangen, het andere paar tangen te gebruiken om de dooierzak te penetreren en vervolgens de dooierzak te scheiden terwijl het chorion wordt verwijderd om de dooiereiwitten naar buiten te laten komen.OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de dooiereiwitten in deze stap te verwijderen. De overvloedige dooiereiwitten in het monster interfereren met latere analyse. Breng de ontdooierde embryo’s over in een buis van 1,5 ml.OPMERKING: Draai de plaat om de ontdooierde embryo’s te centreren, wat het verzamelen vergemakkelijkt. Het lichtere chorionpuin verdwijnt tijdens dit proces. Nadat de embryo’s op de bodem van de buis zijn neergedaald, verwijdert u het supernatant en voegt u 1 ml gekoelde HEPES-gebufferde zoutoplossing (pH 7,6) toe. Herhaal stap 6.2.5 nog twee keer. (Optioneel) Als u niet van plan bent om onmiddellijk door te gaan met de volgende stap, verwijdert u de buffer, vriest u de monsters in vloeibare stikstof en bewaart u ze bij -80 °C.OPMERKING: Ontdooierde viskorrels kunnen worden ingevroren in vloeibare stikstof en worden bewaard bij -80 °C. Flash-ingevroren monsters kunnen tot 2 weken bij -80 °C worden bewaard. Resuspendeer de viskorrels in lysisbuffer.OPMERKING: Lysisbuffer (pH 7,6) bestaat uit 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,3 mM TCEP, 2x Roche cOmplete Mini EDTA-vrije proteaseremmers en 0,1 mg / ml trypsineremmer uit sojabonen. Eén embryo geeft ongeveer 2 μg lysaat. Gebruik 100 μL lysisbuffer voor elke 120 embryo’s. Twee Roche cOmplete Mini EDTA-vrije proteaseremmers en trypsineremmers uit sojabonen moeten vlak voor gebruik aan de lysisbuffer worden toegevoegd. Voeg 20% v/v zirkoniakralen toe aan de tube. Vortex gedurende 20 s, flash bevriezen in vloeibare stikstof en ontdooien in een waterbad van 37 °C. Herhaal stap 6.2.10 nog twee keer. Centrifugeer de oplossing bij 21.000 x g bij 4 °C gedurende 10 min. Breng het supernatant over in een nieuwe, voorgekoelde buis van 1,5 ml. Meet de eiwitconcentratie met bradford-assay. Verdun het lysaat tot 1 mg/ml. Breng voor elke aandoening 170 μg lysaat over in een buis van 2 ml. Meng het lysaat uit stap 6.2.16 met 0,2 mg/ml TeV-protease (S219V) en incubeer de oplossing bij 37 °C gedurende 30 minuten.OPMERKING: Voor niet-TeV protease-behandelde groepen, meng eenvoudig het lysaat met een gelijke voloume van lysisbuffer tot de TeV-proteaseoplossing die in andere groepen wordt gebruikt. Bereid een 10x mastermix voor de biotine-azide klikreactie: 10% w/v SDS, 10 mM CuSO4, 1 mM Cu(TBTA), 1 mM biotine-azide en 20 mM TCEP.OPMERKING: Voeg TCEP toe aan de mix net voor stap 6.2.19. Voeg 8,5 μL t-BuOH en 17 μL 10x klikreactiemastermix toe aan het (TeV-protease-verteerde) lysaat uit stap 6.2.17. Vortex, centrifugeer en incubeer de oplossing bij 37 °C gedurende 15 minuten. Voeg nog eens 1 mM TCEP toe aan de oplossing en vervolgens vortex, centrifugeer en incubeer de oplossing bij 37 °C gedurende nog eens 15 minuten. De incubatietijd voor stappen 6.2.19-6.2.20 is in totaal 30 minuten.OPMERKING: Dit supplement van TCEP, een reducerend reagens voor het genereren van Cu(I), verbetert de klikreactie-efficiëntie. Voeg 600 μL -20 °C ethanol toe aan elke buis, draai de oplossing en incubeer deze ‘s nachts bij -80 °C.OPMERKING: De monsters kunnen gedurende 1 week bij -80 °C worden bewaard; Zo niet, ga dan onmiddellijk verder met de volgende stap. Centrifugeer de oplossing bij 21.000 x g bij 4 °C gedurende 1 uur.OPMERKING: Een pellet moet zich vormen in de bodem van de buis na het centrifugeren, wat de gewenste fractie is. Verwijder het supernatant, voeg 1 ml -20 °C ethanol, vortex toe en centrifugeer de oplossing bij 21.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten. Herhaal stap 6.2.23. Verwijder het supernatant, voeg 1 ml aceton -20 °C toe, vortex en centrifugeer de oplossing bij 21.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant. Laat overtollige resterende aceton verdampen, maar niet volledig uitdrogen. Resuspendeer de pellet in 100 μL resuspensiebuffer (8% m/v lithiumdodecylsulfaat [LDS], 1 mM EDTA in 50 mM HEPES-zoutoplossing, pH 7,6), vortex gedurende 15 s en soniceer totdat de pellet is opgelost. Centrifugeer de oplossing bij 21.000 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten. Breng het supernatant over in een nieuwe buis van 2 ml en voeg 1,5 ml 50 ml HEPES-zoutoplossing toe, pH 7,6.OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van LDS in deze stap is 0,5%. Hogere LDS-concentraties kunnen de pull-down-efficiëntie ondermijnen. Dus, hoewel het verhogen van de LDS-concentratie kan helpen bij het verminderen van niet-specifieke binding, kan het ook de efficiëntie van de pulldown verminderen. Daarom wordt aanbevolen om de LDS-concentratie bij deze stap niet te wijzigen. Verzamel het “input”-monster (figuur 3): breng 30 μL 1 mg/ml lysaat over in een nieuwe buis van 1,5 ml en voeg 10 μl 4x Laemmli-monsterbuffer toe met 6% β-Mercaptoethanol (BME). Bevries de oplossing in en bewaar deze bij -80 °C. Breng 100 μL bedvolume streptavidin hars met hoge capaciteit over in een nieuwe buis van 2 ml. Voeg 1 ml 0,5% LDS toe in 50 mM HEPES-zoutoplossing (pH 7,6), centrifugeer bij 1.500 x g bij RT gedurende 2 minuten en verwijder het supernatant. Herhaal de was met nog eens 1 ml 0,5% LDS in 50 mM HEPES zoutoplossing (pH 7,6). Breng de oplossing van stap 6.2.29 over in de buis met voorgewassen streptavidinehars met hoge capaciteit uit stap 6.2.31 en incubeer de oplossing gedurende 4-6 uur op een end-over-end mixer bij RT. Centrifugeer het mengsel bij 1.500 x g bij RT gedurende 2 minuten, neem 30 μL van het supernatant en meng het met 10 μL 4x Laemmli monsterbuffer met 6% BME voor het “doorstroom” monster. Verwijder vervolgens het resterende supernatant.OPMERKING: “Flowthrough” -monsters kunnen worden geanalyseerd door western blotting om de streptavidin pull-down efficiëntie te controleren. Het is essentieel om zoveel mogelijk van het supernatant te verwijderen om de ongebonden eiwitten weg te spoelen. Verwijder eerst het grootste deel van het supernatant met een P-1000-pipet en verwijder vervolgens het resterende supernatant met een P-20-pipet met een gel-laadpunt. Voeg 1 ml 0,5% LDS in 50 mM HEPES-zoutoplossing (pH 7,6) toe aan de hars en incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij RT met end-over-end rotatie. Centrifugeer het mengsel op 1.500 x g bij RT gedurende 2 minuten en verwijder het supernatant.OPMERKING: Meestal is 0,5% LDS voldoende voor het verwijderen van de meeste niet-specifieke bindende eiwitten. Als in de latere analyse nog niet-specifieke bindingssignalen worden gezien, kan de LDS-concentratie in de wasbuffer worden verhoogd. Herhaal stap 6.2.34-6.2.35 nog twee keer. Voeg 40 μL 2x Laemmli monsterbuffer met 6% BME toe aan de hars. Elueer de gebonden eiwitten door het mengsel gedurende 5 minuten bij 98 °C te incuberen. Centrifugeer het mengsel op 21.000 x g bij RT gedurende 5 minuten en breng het supernatant over in een nieuwe buis van 1,5 ml. Dit is het “elute” monster.OPMERKING: Het direct laden van een oplossing met hars uit stap 6.2.38 in de gel kan de SDS-PAGE-analyse beïnvloeden. Laad 20 μL in elke put van 10-baans 10% polyacrylamidegel en voer gelelektroforese uit.OPMERKING: Laat de gel op een lagere spanning (120 V) lopen totdat het kleurstoffront de oplossende gel bereikt en verander de spanning in 170 V. Stop het programma nadat het kleurstoffront eruit komt. Voer western blotting uit met anti-HA, anti-Halo of andere antilichamen die huishoudeiwitten detecteren (figuur 3). Optie 3: Transcriptomische analyse. RNA-seq en qRT-PCR (figuur 4)OPMERKING: Het wordt sterk aanbevolen om embryo’s te gebruiken die binnen 15 minuten van elkaar zijn gelegd voor deze test. Het leeftijdsverschil van de embryo’s heeft een aanzienlijke invloed op de testresultaten.Verdoof de embryo’s door ze te incuberen bij 4 °C gedurende 10 min, 2 uur na Z-REX. Voer dechorionatie uit met een scherpe tang (stap 6.1.3). (Optioneel) Voer segmentatie uit met een tang (bijvoorbeeld de kop van de staart scheiden) als verschillende segmenten afzonderlijk moeten worden geanalyseerd. Als u RNA uit een heel embryo haalt, breng dan drie tot vijf embryo’s over in een buis van 1,5 ml. Als u RNA uit de kop of staart haalt, breng dan 10-12 ontlede segmenten over in een buis van 1,5 ml.OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het experiment uit te voeren met drie tot vijf biologische replicaties. Voeg 1 ml TRIzol-reagens en glasparels toe aan de buis.OPMERKING: Het bleek dat glaskralen beter werken dan zirkonia-kralen voor RNA-extractie. Vortex het mengsel gedurende 30 s.OPMERKING: Als u niet onmiddellijk doorgaat met de volgende stap, kan de oplossing gedurende 1-3 weken bij -80 °C worden bewaard. Extraheer het RNA volgens de instructies van de fabrikant. Beoordeel de RNA-kwaliteit en -concentratie door microvolumespectrofotometer en agarosegel-elektroforese.OPMERKING: RNA van goede kwaliteit moet een A260/A 280-verhouding hebben van ongeveer of boven 2,0. Dien het RNA in voor sequencing, of behandel 1 μg RNA met DNase I van amplificatiekwaliteit en reverse transcribeer met behulp van superscript III reverse transcriptase en oligo-(dT)20. Voer deze stap uit volgens de instructies van de fabrikant. Voer qRT-PCR uit en analyseer de gegevens volgens de ΔΔCT-methode9 (figuur 4B-D). Optie 4: POI-expressie en colokalisatieanalyse. Immunofluorescentiekleuringstest met gehele montage (figuur 5)OPMERKING: Formaldehyde-gefixeerde embryo’s zijn kwetsbaar. Vermijd krachtig schudden en ga voorzichtig om.Dechorioneer de embryo’s door de stappen 6.1.1-6.1.3 te volgen. Breng de embryo’s over in een buis van 1,5 ml.OPMERKING: Elke buis moet een gelijk aantal embryo’s hebben en niet meer dan 40 embryo’s. Nadat de embryo’s zich op de bodem van de buis hebben gevestigd, verwijdert u het supernatant en voegt u 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7,6) toe. Herhaal stap 6.4.3 nog een keer. Verwijder het supernatant, voeg 1 ml 4% formaldehyde toe in PBS (pH 7,6) en incubeer de buis bij 4 °C gedurende een nacht met zacht schommelen.OPMERKING: De monsters in formaldehyde-oplossing kunnen gedurende 1 week bij 4 °C worden bewaard. Verwijder het supernatant, voeg 1 ml methanol van -20 °C toe en incubeer de buis op zijn kant bij -20 °C gedurende ten minste 18 uur.OPMERKING: De monsters kunnen worden bewaard bij -20 °C gedurende 1 maand of langer. Verwijder het supernatant en voeg 1 ml PDT-buffer toe (0,3% v/v Triton X-100, 0,1% v/v Tween-20 en 1% v/v dimethylsulfoxide [DMSO] in PBS-buffer). Herhaal stap 6.4.7 en incubeer de buis bij RT gedurende 30 minuten met zacht wiegen. Verwijder het supernatant, voeg 1 ml blokkeringsbuffer toe (10% v/v warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum [FBS], 2% w/v runderserumalbumine [BSA] en 0,1% v/v Tween-20 in PBS-buffer) en incubeer de buis bij RT gedurende 1 uur met zacht schommelen. Verwijder het supernatant en voeg 200 μL primaire antilichaamoplossing toe (verdund in blokkeringsbuffer). Verwijder het supernatant, voeg 500 μL primaire antilichaamoplossing toe (verdund in blokkeringsbuffer) en incubeer de buis bij 4 °C gedurende een nacht met zacht schommelen.OPMERKING: Als u een nieuw primair antilichaam gebruikt, is het de moeite waard om enkele monsters zonder primaire antilichaamkleuring op te nemen om als negatieve controles te dienen. Idealiter zijn morfolino-knockdown- of gemanipuleerde gen-knock-outembryo’s, of embryo’s waarin de expressie van het doeleiwit is gestimuleerd, echter betrouwbaardere middelen om het antilichaam te valideren. Verwijder het supernatant, voeg 1 ml PDT-buffer toe en incubeer de buis op RT gedurende 30 minuten met zacht wiegen. Herhaal stap 6.4.12. Verwijder het supernatant, voeg 1 ml blokkeringsbuffer toe en incubeer de buis bij RT gedurende 1 uur met zacht schommelen.OPMERKING: De monsters moeten na deze stap worden beschermd tegen licht om fotobleking van de fluorofoor geconjugeerd op het secundaire antilichaam te voorkomen. Verwijder het supernatant en voeg 200 μL secundaire antilichaamoplossing toe (verdund in blokkeringsbuffer). Verwijder het supernatant, voeg 500 μL secundaire antilichaamoplossing toe (verdund in blokkeringsbuffer) en incubeer de buis bij RT gedurende 1,5 uur met zacht schommelen. Verwijder het supernatant, voeg 1 ml PDT-buffer toe en incubeer de buis op RT gedurende 30 minuten met zacht wiegen. Herhaal stap 6.4.17. Monteer de embryo’s op een 2% agaroseplaat (gemaakt met PBS, pH 7,6) en beeld de embryo’s af met een stereomicroscoop (helder veld en respectievelijke fluorescerende kanalen) (figuur 5A, B, D, F).OPMERKING: Als u de Leica M165 FC fluorescentiestereomicroscoop gebruikt, gebruik dan een vergroting van 25x om beelden met een goede resolutie te verkrijgen. Kwantificeer/analyseer de intensiteit van het fluorescerende signaal door ImageJ (NIH). Gebruik het gereedschap Freehand Selection in ImageJ om het signaal in de betreffende regio te kwantificeren.