ゼブラフィッシュ仔魚のオンターゲットシグナル伝達応答のモニタリング - Z-REXは求電子薬と代謝物の正確なメカニズムを明らかにします

コーネル大学(米国)でのゼブラフィッシュの飼育および取り扱い手順は、国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに従って実施され、施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。スイス連邦工科大学ローザンヌ校(EPFL、スイス)のゼブラフィッシュユニットでのゼブラフィッシュの飼育および取り扱い手順は、動物福祉法SR 455および動物福祉条例SR 455.1に従って、州の獣医認可VD-H23で実施されました。 注:このプロトコルでは、Z-REXを実証するために、Halo-TeV-Keap1を発現する Tg(lyz:TagRFP )および Tg(mpeg1:EGFP) 魚類系統が使用されます。この方法は、目的の他のタンパク質、トランスジェニックレポーターフィッシュ系統、および下流の生物学的アッセイに拡張できます。本試験で使用したバッファーについては、 補足表1 を参照してください。すべての試薬、機器、機器、抗体、プラスミド、ゼブラフィッシュ株および機器は、 材料表に記載されています。 1. mRNAの調製 mMessage mMachine SP6 in vitro 転写キットを使用して、Halo-TeV-Keap1-2xHA および Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA mRNA を調製します。注:製造元の指示に従って、各mRNAに対して40 μLスケールの反応を実行します。mRNAペレットを10 μLのヌクレアーゼフリー水に再溶解します。 mRNAの品質を評価し、マイクロボリューム分光光度計とアガロースゲル電気泳動で濃度を測定します。良質のmRNAは、A260/A280 比が約2.0以上である必要があります。 mRNAをヌクレアーゼフリー水で1-1.5 mg/mLに希釈します。 mRNA溶液をアリコートし(チューブあたり1〜2 μL)、アリコートを-80°Cで保存します。 2. 魚類の胚の産生 オプション1:野生型(WT)魚の胚を産生する。10の別々のタンクに10の魚の交配ペアを設定し、各タンクにはオスとメスの親魚の間の仕切りが含まれています。注:合計10の交差ペアは、通常、アッセイに十分な数の胚を提供します。交配ペアの数は、実験デザイン/必要性および親魚の繁殖力に応じて調整することができる。 翌朝、インジェクターを設置した後、5つのタンクの仕切りを取り外します。魚が交尾するまで30分待ちます。 親魚を別の水槽に移し、水槽の水をストレーナーに通して胚を採取し、ストレーナーから10cmのシャーレに胚を洗い流します。これらの胚は注射の最初のラウンドに使用されます。注:特定のバッチからの卵の品質が悪い場合(たとえば、タンパク質の凝集のために卵が不透明である場合)、それらを他の胚とプールしないでください。 (オプション)次の注入ラウンドのために、他の5つのタンクで手順2.1.2-2.1.3で説明されているのと同様の手順を実行します。注:胚間の年齢差を最小限に抑えるために、1回の注射のみを行うのが最善です。ただし、1ロットで注入できるよりも多くの胚が必要な場合は、mRNA注入中に胚が1〜4細胞段階にとどまるように、2ラウンドの注入を行うことをお勧めします。射出ラウンドの数は、オペレーターの射出スキルと実験計画に応じて調整できます。しかしながら、2時間以内に全手順(最初の仕切りの除去から最後の胚の注入まで)を実行することが推奨される。胚間の年齢差が大きいと、実験結果の信頼性と再現性が損なわれる可能性があります。 オプション2:ヘテロ接合性トランスジェニック好中球/マクロファージレポーター魚胚の産生。10の別々のタンクに10の魚の交配ペアを設定し、各タンクにオスとメスの親魚の間に仕切りを挿入します:WT魚対 Tg(lyz:TagRFP)、またはWT魚対 Tg(mpeg1:eGFP)。注:ホモ接合型レポーター魚はヘテロ接合型魚と比較して高い蛍光シグナルを示すため、下流の蛍光読み出しに影響を与える可能性のあるヘテロ接合型トランスジェニック魚間の交配は避けてください。トランスジェニックレポーターラインとWT胚は、イメージング時に容易に区別することができる。同じプール内にWTとヘテロ接合胚の混合物があることは問題ではありません。 lyz:TagRFP は好中球を報告し、 mpeg:eGFP はマクロファージを報告します。このプロトコルは、他のレポーターフィッシュラインにも適用できます。 手順 2.1.2-2.1.4 に従います。 3.マイクロインジェクターのセットアップ 空気源をオンにし、背圧を0.2〜0.5psiに設定し、射出圧力を25〜30psiに設定します。示されている圧力の特定の範囲は、通常推奨されます。注意: 魚培地が針に逆流するのを防ぐために、安定した背圧を持つことが不可欠です。ステップ3.8で注入量を校正するときは、射出時間のみを変更する必要があります。次の手順では、射出圧力を変更しないでください。低い注入圧力は表面および界面張力による注入の失敗につながる可能性がありますが、高い注入圧力は胚を損傷する可能性があります。 装置と注入プラットフォームをRNase除染溶液で洗浄します。注:mRNAを分解するRNaseは、オペレーターまたは機器から発生する可能性があります。実験前にクリーンアップを行い、手袋を着用する必要があります。 (オプション)mRNAとモルホリノを同時注入する場合は、0.2 mLチューブで2つをプレミックスします。注:Z-REXは、250-1500 ng/μLの濃度のHalo-TeV-Keap1-2xHA mRNA溶液を使用することでうまく機能します。ゼブラフィッシュにはいくつかのモルホリノも使用されており、最適な濃度が報告されています7。未発表配列のモルホリノを使用する場合、オペレーターはZ-REXで使用する前に、まずモルホリノの毒性と遺伝子ノックダウン効率を評価する必要があります。 1〜2 μLのmRNA(および/または該当する場合はモルホリノ7)をマイクロローダーピペットチップを備えた注射針に移します。注意: フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラーで針を準備する場合、セットアップは次のとおりです。熱:520ユニット;引張強度:60ユニット;速度:70単位;遅延:155ユニット。圧力:550単位;ランプ:530ユニット。 マイクロインジェクションマニピュレーターに針を取り付けます。注:空気源からの背圧により、mRNA(/モルホリノ)溶液が針先に押し込まれます。 鋭利な鉗子またはかみそりの刃を使用して針先を壊し、注射に適した開口部を作成します。 針先をステージマイクロメーター上の鉱物油に浸します。 2つまたは3つの注入パルスを適用して、チップの気泡を取り除きます。 射出時間を変更して、液滴サイズを2 nLに校正します。注:これは、血球計算盤に置かれた鉱油(卵黄嚢の粘度を模倣する)に注入することによって最もよく実行されます。顕微鏡を使用して、血球計算盤のグリッド線を使用して、注射中に形成される液滴のサイズを推定し、それに応じて注入時間を調整します。フェノールレッド色素が用いられることもあるが、ここに記載のmRNA注入手順においてその必要性は観察されていない。 4.マイクロインジェクション 注入プレートに新しい10%ハンクス平衡塩溶液(HBSS)培地を満たし、プレートの溝内の胚を鈍い鉗子で整列させます。注:注入プレートは、10%HBSS培地中の2%アガロースで調製されます。溝はプラスチック金型を使用して形成されます。 注射プレートの針先を10%HBSS培地に浸します。 2つまたは3つの注入パルスを適用して、チップの気泡を取り除きます。 注射ごとに、絨毛膜と卵黄嚢を1回の動きで貫通し、注入パルスを適用します。この注入された液体は、注射直後に卵黄嚢内の小さな回転楕円体として見ることができます。この小さな回転楕円体は比較的急速に消散します。十分な数の注入された胚が得られるまで、他の胚についてもこの手順を繰り返します。注:胚の生存率(注射された胚と注射されていない胚の両方)は、通常、50%〜90%の範囲で変動します。各対照/実験グループに必要な胚の数を2倍に注入することを目指します。ビオチンプルダウンアッセイでは、各条件に対して100〜140個の生存可能な胚が必要です。qRT-PCRアッセイでは、各条件に対して5つの生存可能な胚が推奨されます。生きた魚のイメージングとホールマウント免疫蛍光染色アッセイのサンプルサイズはユーザー定義です。分析において良好な統計的検出力を得るためには、条件ごとに少なくとも20個の生存可能な胚を有することが推奨される。 注入された胚を、新鮮な10%HBSS培地を含む新しい10cmのペトリ皿に洗い流します。注:胚は、噴出ボトルを使用して溝から簡単に洗い流すことができます。 注入されていない胚を別のプレートにプールします。注:注射されていない胚は、必要に応じて、魚の健康、ベースラインタンパク質発現、バックグラウンド蛍光レベルなどの品質管理として役立ちます。注射手順がうまく機能し、注入されたmRNA/モルホリノが胚に致命的でない場合、注入された胚と注入されていない胚は同様の生存率を持つはずです。 5. Z-レックス 注入した胚を、実験のセットアップ(対照群/実験群の数)に従って10cmの皿に分配します。 赤色光照明のある暗い部屋で、培地を1 μM Ht-PreHNE(アルキン)の有無にかかわらず、30 mLの10%HBSSと交換します。注:Ht-PreHNE(アルキン)は軽質に不安定な化合物です。胚は以下のステップで暗所に保たれるべきです。 胚を暗所で28.5°Cでインキュベートします。 30.5 hpfで、暗い部屋で、培地を新しい30 mLの10%HBSSと交換します。メモ: メディアを交換するときは、できるだけ古いメディアを取り外してください。これは、胚から非結合/過剰量のHt-PreHNE(アルキン)を除去するために重要です。 胚を28.5°Cの暗所で30分間インキュベートします。 手順5.4〜5.5をさらに2回繰り返します。 UVランプ(365 nm、3 mW / cm2)を5分間オンにして、ランプを予熱します。注意: lamp 事前加温手順は、手順5.8の前に実行する必要があります。ランプの電力は、電源を入れてから最初の数分で低下/不安定になります。ランプの電力は、UVメーターで定期的に測定する必要があります。 32 hpfで、胚を紫外線にさらします。オプション1:生きた魚のイメージング、全マウント免疫蛍光染色、ゲル内蛍光分析(Cy5アジドとのクリックカップリング)、RNA-seq、qRT-PCRなどのダウンストリーム読み出しでは、胚をUV光に3分間さらし、30秒ごとにプレートを旋回させます。 オプション2:ビオチンプルダウンアッセイなどの下流の読み出しでは、胚をUV光に最大5分間(最小3分間)さらし、30秒ごとにプレートを旋回させ、プレートを氷上で1分間冷却します。注:異なるプローブを使用する場合は、特定のフォトケージ付き求電子プローブと展開された光源のフォトアンケージングの t1/2 に応じて、光露光時間を最適化する必要があります。 t1/2フォトアンケージング は、公知の手順8を用いて決定することができる。Ht-PreHNE(アルキン)の場合、 t1/2 は1分3<。したがって、上記の時間で十分です。 6. ダウンストリームアッセイ オプション1:表現型アッセイ。トランスジェニック好中球/マクロファージレポーターのライブイメージングフィッシュライン、Tg(lyz:TagRFP)およびTg(mpeg1:eGFP)(図2)胚を4°Cで10分間インキュベートして麻酔します。注:条件ごとに少なくとも20個の生存可能な胚を持つことが推奨されます。 未受精/死んだ胚をプレートから取り除きます。注:未受精/死んだ胚は曇っている/不透明であり、視覚的に識別することができます。高い死亡率が見られる場合は、注射手順に戻るか、mRNAまたはモルホリノの濃度を下げるようにしてください。 鋭い鉗子で胚を脱振膜します。幼虫の魚に触れずに1組の鉗子で絨毛膜を持ち、もう一方の鉗子を使用して絨毛膜をはぎ取ります。胚は壊れやすいです。デコリオンを行うときだけ絨毛膜に触れてください。注:特に初心者では、デコリオン中にいくつかの胚を損傷するのが一般的です。したがって、常に必要最低限よりも多くの胚を持っています。 胚を2%アガロースプレート(10%HBSS培地で調製)にマウントし、実体顕微鏡(明視野およびそれぞれの蛍光チャネル)で胚を画像化します(図2A、C、G)。注:Z-REX [Halo-TeV-Keap1-2xHA mRNA 注射と Ht-PreHNE(アルキン)治療の組み合わせ]後、好中球の枯渇(lyz:TagRFP)は36 hpf(Z-REX後4時間)で最も顕著であることがわかりましたが、マクロファージ(mpeg1:eGFP)の減少は34 hpf(Z-REX後2時間)で最も顕著でした(図2E、F)。異なるレポーターライン、mRNA/モルホリノ、またはプローブを使用する場合は、他の時点を使用できます。露光時間および/またはゲインは、単一細胞または所望の特定の(超)構造を視覚化するために最適化する必要があります。 ImageJ(NIH)によって各魚の好中球/マクロファージ数を数えます(図2B、D-F、H)。ImageJのフリーハンド選択ツールを使用して魚全体を丸で囲み、オプション[最大値の検索]を使用して蛍光細胞をカウントします。 オプション2:ターゲットラベリング評価。ビオチンアジドクリックカップリングおよびビオチンプルダウンアッセイ(図 3)4°Cで培養して胚を麻酔します。 これには通常10分かかります。注:十分な魚の溶解物を得るには、各条件に100〜140個の生存可能な胚が必要です。 未受精/死んだ胚をプレートから取り除きます。 デコリオンと脱黄を行います。絨毛膜を一対の鋭い鉗子で保持し、もう一方の鉗子を使用して卵黄嚢を貫通し、次に絨毛膜を除去しながら卵黄嚢を分離して卵黄タンパク質が出てくるようにすることで、2つの操作を実行します。注:このステップでは、卵黄タンパク質を除去することが重要です。サンプル中の豊富な卵黄タンパク質は、後の分析を妨げます。 脱卵胚を1.5 mLチューブに移します。注:プレートを回転させて脱卵胚を中央に配置すると、収集が容易になります。このプロセス中に、軽い絨毛膜の破片が消えます。 胚がチューブ底に落ち着いたら、上清を取り除き、冷やしたHEPES緩衝生理食塩水(pH 7.6)を1 mL加えます。 手順 6.2.5 をさらに 2 回繰り返します。 (オプション)すぐに次のステップに進むつもりがない場合は、バッファーを除去し、サンプルを液体窒素で瞬間凍結し、-80°Cで保存します。注意: 脱卵魚のペレットは、液体窒素で瞬間冷凍し、-80°Cで保存できます。 瞬間凍結サンプルは、-80°Cで最大2週間保存できます。 魚のペレットを溶解バッファーに再懸濁します。注:溶解バッファー(pH 7.6)は、50 mM HEPES、100 mM NaCl、1% Triton X-100、0.3 mM TCEP、2x Roche cOmplete Mini EDTAフリープロテアーゼ阻害剤、および大豆由来の0.1 mg/mLトリプシン阻害剤で構成されています。1つの胚は約2μgの溶解物を与えます。120個の胚ごとに100 μLの溶解バッファーを使用します。大豆由来の2つのロシュcOmplete Mini EDTAフリープロテアーゼ阻害剤およびトリプシン阻害剤は、使用直前に溶解バッファーに添加する必要があります。 20%v/vジルコニアビーズをチューブに追加します。 20秒間ボルテックスし、液体窒素中で瞬間凍結し、37°Cの水浴中で解凍する。 手順 6.2.10 をさらに 2 回繰り返します。 溶液を21,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を新しい予冷した1.5 mLチューブに移します。 ブラッドフォードアッセイによりタンパク質濃度を測定する。 ライセートを1 mg/mLに希釈します。 各条件について、170 μgのライセートを2 mLチューブに移します。 ステップ6.2.16のライセートを0.2 mg/mL TeVプロテアーゼ(S219V)と混合し、溶液を37°Cで30分間インキュベートします。注:TeVプロテアーゼ処理されていないグループの場合は、ライセートを他のグループで使用されているTeVプロテアーゼ溶液と同等の体積の溶解バッファーと混合するだけです。 ビオチン-アジドクリック反応用の10xマスターミックスを調製します:10% w/v SDS、10 mM CuSO4、1 mM Cu(TBTA)、1 mM ビオチン-アジド、および20 mM TCEP。メモ: ステップ 6.2.19 の直前に TCEP をミックスに追加します。 ステップ6.2.17の(TeVプロテアーゼ消化)ライセートに8.5 μLのt-BuOHと17 μLの10xクリック反応マスターミックスを加えます。ボルテックス、遠心分離機、および溶液を37°Cで15分間インキュベートします。 さらに1 mM TCEPを溶液に加え、ボルテックス、遠心分離、37°Cでさらに15分間インキュベートします。ステップ6.2.19-6.2.20のインキュベーション時間は合計30分です。注:Cu(I)を生成するための還元試薬であるTCEPのこのサプリメントは、クリック反応効率を向上させます。 各チューブに600 μLの-20°Cエタノールを加え、溶液をボルテックスし、-80°Cで一晩インキュベートします。注:サンプルは-80°Cで1週間保存できます。そうでない場合は、すぐに次の手順に進みます。 溶液を21,000 x g で4°Cで1時間遠心分離します。注:ペレットは、遠心分離後にチューブの底に形成されるはずであり、これは所望の画分である。 上清を取り除き、1 mLの-20°Cエタノール、ボルテックスを加え、溶液を21,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 手順 6.2.23 を繰り返します。 上清を除去し、1 mLの-20°Cアセトン、ボルテックスを加え、溶液を21,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を除去する。余分な残留アセトンを蒸発させますが、完全に乾くわけではありません。 ペレットを100μLの再懸濁バッファー(8%w / vドデシル硫酸リチウム[LDS]、50mM HEPES生理食塩水中の1mM EDTA、pH 7.6)に再懸濁し、15秒間ボルテックスし、ペレットが溶解するまで超音波処理します。 溶液を室温(RT)で21,000 x g で5分間遠心分離します。 上清を新しい2 mLチューブに移し、1.5 mLの50 mM HEPES生理食塩水、pH 7.6を加えます。注:このステップでのLDSの最終濃度は0.5%です。LDS濃度が高いと、プルダウン効率が低下する可能性があります。したがって、LDS濃度を増加させることは非特異的結合の減少を助けることができるが、それはまたプルダウンの効率を低下させる可能性がある。したがって、このステップではLDS濃度を変更しないことをお勧めします。 「インプット」サンプルを収集します(図3):30 μLの1 mg/mLライセートを新しい1.5 mLチューブに移し、6%β-メルカプトエタノール(BME)を含む10 μLの4x Laemmliサンプルバッファーを追加します。溶液を瞬間凍結し、-80°Cで保存します。 床容量のストレプトアビジン大容量樹脂100 μLを新しい2 mLチューブに移します。50 mM HEPES生理食塩水(pH 7.6)に0.5% LDS1 mLを加え、RTで1,500 x g で2分間遠心分離し、上清を除去します。50 mM HEPES生理食塩水(pH 7.6)中の0.5%LDSをさらに1 mLで洗浄を繰り返します。 ステップ6.2.29の溶液をステップ6.2.31で予備洗浄したストレプトアビジン大容量樹脂を含むチューブに移し、RTのエンドオーバーエンドミキサーで4〜6時間インキュベートします。 混合物をRTで1,500 x g で2分間遠心分離し、30 μLの上清を取り、「フロースルー」サンプル用に6%BMEを含む10 μLの4x Laemmliサンプルバッファーと混合します。その後、残った上清を除去する。注:「フロースルー」サンプルは、ストレプトアビジンのプルダウン効率を確認するためにウェスタンブロッティングで分析できます。結合していないタンパク質を洗い流すために、できるだけ多くの上清を除去することが不可欠です。まず、P-1000ピペットを用いて上清の大部分を除去し、次いでゲルローディングチップ付きP-20ピペットを用いて残りの上清を除去する。 50 mM HEPES生理食塩水(pH 7.6)中の0.5% LDS1 mLを樹脂に加え、エンドオーバーエンド回転しながらRTで30分間インキュベートします。 混合物をRTで1,500 x g で2分間遠心分離し、上清を除去します。注:通常、0.5%LDSは、ほとんどの非特異的結合タンパク質を除去するのに十分です。後の分析で非特異的結合シグナルが依然として見られる場合は、洗浄バッファー中のLDS濃度を高めることができます。 手順 6.2.34-6.2.35 をさらに 2 回繰り返します。 6%BMEを含む40 μLの2x Laemmliサンプルバッファーをレジンに加えます。 結合タンパク質を溶出するには、混合物を98°Cで5分間インキュベートします。 混合物を21,000 x g でRTで5分間遠心分離し、上清を新しい1.5 mLチューブに移します。これは「溶出」サンプルです。注:ステップ6.2.38の樹脂を含む溶液をゲルに直接ロードすると、SDS-PAGE分析に影響を与える可能性があります。 10レーン10%ポリアクリルアミドゲルの各ウェルに20 μLをロードし、ゲル電気泳動を実行します。注:染料前面が分離ゲルに達するまでゲルをより低い電圧(120 V)で実行し、電圧を170 Vに変更します。 ハウスキーピングタンパク質を検出する抗HA、抗Halo、またはその他の抗体を用いてウェスタンブロッティングを行います(図3)。 オプション3:トランスクリプトーム解析。RNA-seq および qRT-PCR (図4)注:このアッセイには、互いに15分以内に産卵された胚を使用することを強くお勧めします。胚の年齢差はアッセイ結果に大きく影響します。Z-REXの2時間後に胚を4°Cで10分間インキュベートして麻酔します。 鋭い鉗子でデコリオンを実行します(ステップ6.1.3)。 (オプション)異なるセグメントを別々に分析する場合は、鉗子を使用してセグメンテーションを実行します(たとえば、頭を尾から分離します)。 胚全体からRNAを抽出する場合は、3〜5個の胚を1.5 mLチューブに移します。頭部または尾部からRNAを抽出する場合は、10〜12個の解剖セグメントを1.5 mLチューブに移します。注:3〜5回の生物学的複製で実験を行うことをお勧めします。 1 mLのTRIzol試薬とガラスビーズをチューブに加えます。注:ガラスビーズは、RNA抽出においてジルコニアビーズよりもうまく機能することがわかった。 混合物を30秒間ボルテックスします。注:次のステップにすぐに進まない場合は、溶液を-80°Cで1〜3週間保存できます。 製造元の指示に従ってRNAを抽出します。 微量分光光度計とアガロースゲル電気泳動によりRNAの品質と濃度を評価します。注:良質のRNAは、A260/A280 比が約2.0以上である必要があります。 RNAをシーケンシングのために提出するか、1 μgのRNAを増幅グレードのDNase Iで処理し、上付き文字III逆転写酵素およびオリゴ(dT)20を使用して逆転写します。製造元の指示に従ってこの手順を実行してください。 qRT-PCRを行い、ΔΔCT法9(図4B-D)によりデータを解析する。 オプション4:POI発現と共局在解析。ホールマウント免疫蛍光染色アッセイ(図5)注:ホルムアルデヒド固定胚は壊れやすいです。激しい揺れを避け、取り扱いには注意してください。ステップ6.1.1-6.1.3に従って胚を脱絨毛させます。 胚を1.5 mLチューブに移します。注:各チューブには、同数の胚と40個以下の胚が必要です。 胚がチューブの底に落ち着いたら、上清を取り除き、1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH 7.6)を加えます。 手順 6.4.3 をもう一度繰り返します。 上清を除去し、PBS(pH 7.6)に4%ホルムアルデヒド1 mLを加え、チューブを4°Cで一晩穏やかに揺らしながらインキュベートします。注:ホルムアルデヒド溶液中のサンプルは、4°Cで1週間保存できます。 上清を除去し、1 mLの-20°Cメタノールを加え、チューブの側面を-20°Cで少なくとも18時間インキュベートします。注:サンプルは-20°Cで1ヶ月以上保存できます。 上清を除去し、1 mLのPDTバッファー(PBSバッファーに0.3%v/vトリトンX-100、0.1%v/vトゥイーン-20、および1%v/vジメチルスルホキシド[DMSO])を加えます。 ステップ6.4.7を繰り返し、チューブをRTで30分間、穏やかに揺らしながらインキュベートします。 上清を除去し、1 mLのブロッキングバッファー(10%v/v熱不活化ウシ胎児血清[FBS]、2%w/vウシ血清アルブミン[BSA]、および0.1%v/v Tween-20PBSバッファー)を加え、穏やかに揺らしながらRTで1時間チューブをインキュベートします。 上清を除去し、200 μLの一次抗体溶液(ブロッキングバッファーで希釈)を加える。 上清を除去し、500 μLの一次抗体溶液(ブロッキングバッファーで希釈)を加え、チューブを4°Cで一晩、穏やかに揺らしながらインキュベートします。注:新しい一次抗体を使用する場合は、一次抗体染色のないサンプルをネガティブコントロールとして含める価値があります。しかし、理想的には、モルホリノノックダウンまたは遺伝子ノックアウト胚、または標的タンパク質の発現が刺激された胚は、抗体を検証するためのより信頼性の高い手段です。 上清を除去し、1 mLのPDTバッファーを加え、チューブをRTで30分間、穏やかに揺り動かしながらインキュベートします。 手順 6.4.12 を繰り返します。 上清を除去し、1 mLのブロッキングバッファーを加え、チューブをRTで1時間、穏やかに揺動しながらインキュベートします。注:二次抗体に結合した蛍光色素の光退色を防ぐために、このステップの後、サンプルを光から保護する必要があります。 上清を除去し、二次抗体溶液200 μL(ブロッキングバッファーで希釈)を加えます。 上清を除去し、500 μLの二次抗体溶液(ブロッキングバッファーで希釈)を加え、チューブをRTで1.5時間、穏やかに揺らしながらインキュベートします。 上清を除去し、1 mLのPDTバッファーを加え、チューブをRTで30分間、穏やかに揺り動かしながらインキュベートします。 手順 6.4.17 を繰り返します。 胚を2%アガロースプレート(PBS製、pH 7.6)にマウントし、実体顕微鏡(明視野およびそれぞれの蛍光チャネル)で胚を画像化します(図5A、B、D、F)。注意: Leica M165 FC蛍光実体顕微鏡を使用する場合は、25倍の倍率を使用して、良好な解像度の画像を取得します。 ImageJ(NIH)による蛍光シグナル強度の定量化/解析ImageJの フリーハンド選択 ツールを使用して、関心領域の信号を定量化します。