رصد استجابات الإشارات على الهدف في يرقات الزرد - يكشف Z-REX عن آليات دقيقة للأدوية والمستقلبات المحبة للكهرباء
Summary
الزرد الذي يستهدف الإلكتروفيل والمؤكسدات التفاعلية (Z-REX) هو طريقة قائمة على البيولوجيا الكيميائية للتحقيق في إشارات الجزيئات الصغيرة التفاعلية. يمكن تطبيق هذه التقنية على الأسماك الحية في مراحل النمو المختلفة. هنا ، نقوم بإقران المقايسات القياسية في الزرد مع Z-REX لتحليل مسار الإشارة.
Abstract
تعد المستقلبات التفاعلية والأدوية المحبة للكهرباء ذات الصلة من بين الجزيئات الصغيرة الأكثر تحديا للدراسة. النهج التقليدية لتفكيك طريقة العمل (MOA) لهذه الجزيئات تستفيد من المعالجة السائبة للعينات التجريبية مع وجود فائض من الأنواع التفاعلية المحددة. في هذا النهج ، فإن التفاعل العالي للإلكتروفيل يجعل وضع العلامات غير التمييزية للبروتين بطريقة تعتمد على الوقت والسياق. يمكن أيضا أن تتأثر البروتينات والعمليات الحساسة للأكسدة والاختزال بشكل غير مباشر وغالبا ما لا رجعة فيه. في ظل هذه الخلفية من الأهداف المحتملة التي لا حصر لها والآثار الثانوية غير المباشرة ، يظل ربط النمط الظاهري بإشراك هدف محدد مهمة معقدة. تم تصميم Zebrafish الذي يستهدف المحبة الكهربائية التفاعلية والمؤكسدات (Z-REX) – وهي منصة توصيل تفاعلية للكهرباء عند الطلب تم تكييفها للاستخدام في يرقات الزرد – لتوصيل الإلكتروفيل إلى بروتين معين مهم (POI) في أجنة الأسماك الحية غير المضطربة. تشمل الميزات الرئيسية لهذه التقنية مستوى منخفضا من الغزو ، إلى جانب توصيل دقيق للجرعة والنمط الكيميائي والزمان المكاني الذي يتم التحكم فيه بالكهرباء. وبالتالي ، بالاقتران مع مجموعة فريدة من الضوابط ، تتجنب هذه التقنية التأثيرات غير المستهدفة والسمية الجهازية ، والتي لوحظت بخلاف ذلك بعد التعرض الجماعي غير المنضبط للحيوانات لمحبة كهربائية تفاعلية وعقاقير محبة للكهرباء متعددة الخواص. بالاستفادة من Z-REX ، يمكن للباحثين إنشاء موطئ قدم في فهم كيفية تغيير استجابات الإجهاد الفردية ومخرجات الإشارات نتيجة لمشاركة الرباط التفاعلية المحددة مع POI محدد ، في ظل ظروف شبه فسيولوجية في الحيوانات الحية السليمة.
Introduction
يتضمن عدد لا يحصى من أحداث الإشارات الخلوية تفاعلات بين جزيئات تفاعلية صغيرة (يتم إنتاجها داخليا في الخلية أو xenobiotics / xenometabolites ، مثل الأدوية) وهدفها البروتيني. في كثير من الحالات ، يمكن أن يؤدي المستوى المتكافئ لأحداث الارتباط التساهمي هذه إلى استجابات خلوية ، مما يؤدي إلى تغييرات ، على سبيل المثال ، في النمو ، والتمثيل الغذائي ، وموت الخلايا المبرمج ، و / أو الاستجابة المناعية1. ومع ذلك ، فقد ثبت أن تفكيك طريقة العمل (MOA) من خلال ربط أحداث ملزمة محددة بعواقبها المظهرية يمثل تحديا. غالبا ما تؤدي طرق جرعات البلعة التقليدية التي تنطوي على إدخال تركيزات عالية من الأنواع التفاعلية إلى تعديل العديد من البروتينات ، فضلا عن السمية المفرطة للكائن النموذجي2. مثل هذه الظروف بعيدة عن المثالية. تم تطوير طريقة لحل هذه المشكلات في زراعة الخلايا باستخدام توصيل إلكتروفيل موضعي دقيق في سياق خلوي أصلي ، يسمى T-REX (المحبة والمؤكسدات التفاعلية القابلة للاستهداف) 3. في السنوات الفاصلة ، تحول التركيز إلى التجارب في الكائنات الحية بأكملها ، والتي تتيح الفرصة لدراسة البروتينات في سياقات خلوية محددة في الخلايا غير المتحولة. وبالتالي ، قمنا بتوسيع التقنية لتكون متوافقة مع العديد من النماذج ، بما في ذلك نماذج جنين Danio rerio . هنا ، نقدم Z-REX (الزرد الذي يستهدف الإلكتروفيل التفاعلي والمواد المؤكسدة) (الشكل 1).
لفهم Z-REX ، تقدم هذه المقالة أولا تقنيات REX ومفاهيمها الأساسية. في جوهرها ، تقوم هذه التقنيات بنمذجة إشارات الأنواع الكهربية التفاعلية الفسيولوجية الداخلية (RES) من خلال محاكاة كيفية إنتاج الإلكتروفيل الطبيعي محليا في الجسم الحي بدقة مكانية زمانية. يتم التعبير عن البروتين محل الاهتمام (POI) كبناء اندماج لهالة. هذا الأخير يثبت المسبار المنفذ للأنسجة والخامل الذي يحمل RES في قفص ضوئي في قياس متكافئ 1: 1. أحد هذه RES الذاتية هو 4-هيدروكسي نونينال (HNE فيما بعد) ، والذي يتم وضعه في قفص ضوئي في المسبار Ht-PreHNE. في كثير من الحالات ، نستخدم نسخة وظيفية من الألكاين من HNE [أي HNE (alkyne)] ، والتي لها خصائص بيولوجية متطابقة بشكل أساسي مع HNE ، ولكن يمكن تسميتها بكيمياء النقر. يشار إلى المسبار ، الذي يعمل أيضا مع كلورو ألكان للتفاعل مع Halo ، باسم Ht-PreHNE (ألكين). يسمح مجمع اندماج Halo-POI والمسبار المتشكل على هذا النحو بالتوصيل القريب ل RES إلى POI المنصهر عند التشعيع بضوء الأشعة فوق البنفسجية. إذا كان POI يتفاعل بسرعة مع الدقة المحررة ، فإن وضع العلامات التساهمية الناتجة ل POI مع RES يسمح لنا بتحديد cysteines ذات الامتيازات الحركية.
يأخذ Z-REX المزايا المذكورة أعلاه لتقنيات REX ويطبقها على نطاق واسع لدراسة مسارات إشارات محددة في الأسماك الحية. تم تحسين هذا البروتوكول لأسماك الزرد (D. rerio) ، لأنها كائنات فقارية قابلة للتتبع وراثيا وشفافة أثناء التطور ، وبالتالي فهي مثالية للتقنيات الكيميائية البصرية / الوراثية مثل تقنيات REX. ومع ذلك ، من المرجح أيضا أن تعمل استراتيجية مماثلة بشكل جيد على أنواع الأسماك الأخرى القابلة للسحب وراثيا ، نظرا لأن التطبيق الواسع للطريقة يرجع إلى الآلية الزائفة داخل الجزيئات لتوصيل الإلكتروفيل المشتق من الدهون (LDE). في الواقع ، الإجراء متوافق حيويا للغاية ، حيث يمكن معالجة الأسماك باستخدام Z-REX photocaged-electrophile [على سبيل المثال ، Ht-PreHNE (alkyne)] لمدة 48 ساعة على الأقل دون أي تأثيرات ملحوظة على النمو. يعمل بروتوكول مماثل في C. elegans 4,5.
يصف البروتوكول أولا استخدام حقن mRNA لإنتاج تعبير عابر عن بنية اندماج Halo-POI غير الأصلية في نماذج الزرد الجنينية ، بعد 1-1.5 يوم من الإخصاب (dpf). ينتج عن هذا التعبير عن البروتين خارج الرحم في غالبية الخلايا داخل الأسماك (يشار إليها فيما يلي باسم “في كل مكان”) ، وليس في أنسجة أو أماكن محددة. ومع ذلك ، تظهر البيانات أنه يمكن ملاحظة التأثيرات الخاصة بالخلية في حالات معينة. بعد الحقن ، يتم تحضين الأجنة بتركيز منخفض [0.3-5 ميكرومتر Ht-PreHNE (ألكاين)] من المسبار لمدة تصل إلى 30.5 ساعة بعد الإخصاب (hpf). بعد ذلك ، في الوقت الذي يحدده المستخدم ، يتم تسليم RES إلى POI داخل الأسماك عن طريق الفك الضوئي لمدة 2-5 دقائق. بعد الفك الضوئي ل RES ، يمكن إجراء مجموعة متنوعة من فحوصات النمط الظاهري النهائية خلال 2-10 ساعات القادمة: 1) التصوير الحي لخطوط المراسل (الشكل 2 أ) ؛ 2) تقييم وضع العلامات المستهدفة من خلال تحليل اللطخة الغربية (الشكل 3) ؛ 3) التحليل النسخي (الشكل 4) ؛ أو 4) التألق المناعي الكامل (الشكل 5).
كمثال على التصوير الحي لخطوط المراسل ، يتم عرض Z-REX جنبا إلى جنب مع التصوير الحي لخطوط الأسماك ، Tg (lyz: TagRFP) و Tg (mpeg1: eGFP) ، لقياس كيفية تعديل RES لنقطة اهتمام محددة لمستشعر كهربائي (أي Keap1) يقلل من مستويات العدلات والبلاعم ، على التوالي ، مع عدم وجود تأثيرات ملحوظة على الخلايا الأخرى في الأسماك. ومع ذلك ، فقد أظهرنا سابقا أنه يمكن إعادة إنتاج علامات POI وإشارات المسار اللاحقة من دراسات T-REX باستخدام Z-REX للعديد من البروتينات: Akt3 6 و Keap17 و Ube2v26. بشكل عام ، مع Z-REX ، يمكن للعلماء دراسة نتيجة (نتائج) التعديل التساهمي لنقاط الاهتمام بواسطة RES في سياق العديد من مسارات الأكسدة والاختزال المعقدة. تم إعداد هذه التقنية لتحديد الأهداف ومخلفاتها الوظيفية لتصميم الأدوية التساهمية وآليات الأدوية الجديدة في نموذج حيواني كامل أكثر صلة بالسياق.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوضح Z-REX الموصوف في هذا البروتوكول استراتيجية قوية لفحص الزوج المستهدف بالكهرباء وإلغاء التفاف مسار الإشارات في الأسماك الحية. يتيح التسليم الموجه عن قرب الجرعة والتحكم المكاني في المعالجة المركبة المحبة للكهرباء. على عكس طرق جرعات البلعة التقليدية ، حيث غالبا ما تؤدي التركيزات فوق الفسيولوجية للإلكتروفيل المنتشرة إلى مشكلات خارج الهدف ، فإن الكمية الصغيرة نسبيا من الإلكتروفيل التي يتم إطلاقها في النظام تجعل Z-REX غير جراحي إلى حد كبير. لقد استخدمنا 0.1-6 ميكرومتر Ht-PreHNE (ألكين) في أجنة الزرد ، وأظهرت النتائج أن العلاج لا يضر بتطور الجنين11.
عادة ما يكون إجراء Z-REX أطول من T-REX ، وهي تقنية لفحص / دراسة البروتينات المستشعرة للكهرباء في الخلايا المزروعة. لنفترض أن الغرض من التجربة هو فحص التفاعلات بين الإلكتروفيل والهدف. نقترح أولا إجراء فحص مكثف بواسطة T-REX في الخلايا المستزرعة واستخدام Z-REX للتحقق من الصحة في الجسم الحي وتحليل الظاهراتية / المسار. بالمقارنة مع زراعة الخلايا ، فإن متطلبات أداء Z-REX هي تقنيات تربية الأسماك الأساسية بالإضافة إلى المهارات التجريبية البيوكيميائية التي تتطلبها T-REX. الإطار الزمني النموذجي ل Z-REX (من عبور الأسماك إلى توصيل الإلكتروفيل القابل للضوء) هو 2-3 أيام ، وهو ما لا يزيد عن يوم واحد أطول من الوقت المعتاد لتجربة T-REX على الخلايا الحية المنقولة. يمكن إجراء التصوير الحي لتحليل النمط الظاهري بعد 2-10 ساعات من إضاءة الضوء ؛ انقر فوق اقتران مع البيوتين أزيد للفحص المنسدل يستغرق 3 أيام ؛ qRT-PCR لفحص استجابة النسخ يستغرق 3 أيام ؛ إذا تلطيخ يستغرق 5 أيام. تشبه هذه الخطوات تقريبا مكافئاتها في زراعة الخلايا ، على الرغم من أن تفسير البيانات يتطلب فهما لفسيولوجيا الأسماك وسلالات المراسل.
كإجراء متعدد المتغيرات12 ، تعد عدة مجموعات تحكم ضرورية ل Z-REX لاستبعاد أوجه عدم اليقين في النتائج (الشكل 1D). مجموعات التحكم الشائعة هي: (1) DMSO / علاج السيارة فقط ؛ (2) معالجة المسبار ، ولكن بدون إضاءة ضوئية ؛ (3) إضاءة الضوء ، ولكن بدون معالجة مسبار ؛ (4) بناء تقسيم P2A ، حيث يتم التعبير عن Halo و POI بشكل منفصل ، لذلك يتم إلغاء تسليم القرب ؛ و (5) طفرات ناقصة الشكل ، والتي يتم تحور بقاياها (بقايا) استشعار الكهرباء ، مثل Akt3 (C119S) 6 و Keap1 (C151S ، C273W ، C288E) 5 ، والتي استخدمناها في الدراسات السابقة.
إذا كانت المقايسات النهائية تتضمن تحليل اللطخة الغربية ، فيجب إجراء deyolking قبل الحصاد. تقلل بروتينات صفار البيض من دقة تقييمات تركيز المحللة وقد ترتبط بشكل غير محدد بالأجسام المضادة. عند إجراء تصوير الأسماك الحية أو تلطيخ IF الكامل ، لاحظنا أيضا إشارات فلورية غير محددة في كيس الصفار ، من المحتمل أن تكون ناتجة عن بروتينات الفلورسنت الذاتي في كيس الصفار ، أو الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة نفسها. إذا كانت إشارة التألق الذاتي تتداخل مع الإشارة ، فإننا نقترح استبعاد كيس الصفار من القياس الكمي ، أو تحديد مناطق مختلفة بشكل منفصل. يعد إزالة البقع ضروريا لتصوير الأسماك الحية ومقايسة تلطيخ IF كاملة التركيب. يمكن أن تتداخل المشيمية مع التصوير ، وبعد ذلك مع القياس الكمي / عد الخلايا. ومع ذلك ، فإن dechorination ينطبق فقط على الأجنة التي يزيد عمرها عن 1 dpf. الأجنة الأصغر سنا في مراحل الانفجار / المعدة / التجزئة هشة للغاية بحيث لا يمكن تفكيكها.
يعتمد بروتوكول Z-REX الموصوف هنا على تعبير POI خارج الرحم الذي يحركه mRNA. الإجراء سريع مقارنة باستخدام / توليد سلالات الأسماك المعدلة وراثيا. التعبير الذي يحركه mRNA موجود في كل مكان وعابر ، ويستمر لمدة 2 أيام على الأقل ل mRNAs المستخدمة في هذا البروتوكول. ومع ذلك ، من المرجح أن تختلف مدة التعبير في حالات أخرى. وبالتالي ، يوفر هذا النهج نافذة تحقيق سريعة وأكثر عالمية في تأثيرات حدث معين لوضع العلامات الكهربائية ، متوافق مع العديد من المقايسات عالية الإنتاجية / عالية المحتوى. الخطوط المعدلة وراثيا مع تعبير Halo-POI المستقر في أنسجة معينة متوافقة أيضا مع Z-REX11. من الأفضل استخدام هذه الخطوط عند الحاجة إلى طرح سؤال أكثر دقة ، على سبيل المثال ، عندما يتم التنبؤ بنمط ظاهري في عضو معين من بيانات زراعة الخلايا ، أو عندما يتنبأ الفحص من تجارب حقن mRNA بأن عضوا معينا حساسا لحدث وضع العلامات الكهربائية. تم إثبات تحريض استجابة مضادات الأكسدة الخاصة بالقلب من خلال Z-REX باستخدام أسماك Tg (gstp1: GFP ؛ DsRed-P2A-myl7: Halo-TeV-Keap1) في منشورنا السابق11. قد يكون من الممكن أيضا إجراء Z-REX على الأسماك المعدلة وراثيا التي يزيد عمرها عن 2 dpf.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
التمويل: نوفارتيس فرينوفيشن ، NCCR ، و EPFL.
Materials
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 10-cm Petri dishes | Celltreat | 229692 | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-C-S | |
| 30% Acrylamide and bis-acrylamide solution | BioRad | 1610154 | |
| 6-well plate | Celltreat | 229506 | |
| Acetone | Fisher | A/0600/15 | |
| Agarose | GoldBio | A201-100 | |
| All Blue Prestained Protein Standards | BioRad | 1610373 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Biotin-dPEG11-azide | Quanta Biodesign | 102856-142 | |
| Bradford Dye | BioRad | 5000205 | |
| BSA | Fisher | BP1600-100 | |
| Capillary tubes | VWR | HARV30-00200 | |
| Chloroform | Supelco, Inc | 1.02445.1000 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Cu(TBTA) | Lumiprobe | 21050 | |
| CuSO4 | Sigma | 209198 | |
| DMSO | Fisher | D128-500 | |
| Donkey anti-mouse-Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150107 | 1:800 (IF) |
| Donkey anti-rabbit-Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150075 | 1:1000 (IF) |
| Donkey anti-rat-AlexaFluor 568 | Abcam | ab175475 | 1:1000 (IF) |
| ECL substrate | Thermo Fisher Scientific | 32106 | |
| ECL-Plus substrate | Thermo Fisher Scientific | 32132 | |
| End-to-end rotator | FinePCR | Rotator AG | |
| Ethanol | Fisher | E/0650DF/15 | |
| Ethidium bromide | Sigma | E1510 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica | M165 FC | |
| Forceps (blunt) | self made | self made by blunting sharp forceps (Fine Science Tools, Dumont #5, 11252-40) | |
| Forceps (sharp) | Fine Science Tools | Dumont #5, 11252-40 | |
| Gel loading tip | Fisher | 02-707-181 | |
| Gel/blot imager | Vilber | Fusion FX imager | |
| Glass beads | Sigma | 45-G1145 | |
| Glass stage micrometer | Meiji Techno. | MA285 | |
| Heat inactivated FBS | Sigma | F2442 | |
| Heated ultrasonic bath | VWR | 89375-470 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| High capacity streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20359 | |
| Ht-PreHNE alkyne probe | self-made | – | Parvez, S. et al. T-REX on-demand redox targeting in live cells. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016). |
| Imaging plate (10% HBSS buffer, for live embryos) | Made with Petri dish, and 2% agarose in 10% HBSS buffer | ||
| Imaging plate (PBS, for formaldehyde-fixed embryos) | Made with Petri dish, and 2% agarose in PBS | ||
| Injection plate | Made with microinjection mold, Petri dish, and 2% agarose in 10% HBSS buffer | ||
| LDS | Apollo | APOBI3331 | |
| Methanol | VWR | 20864.32 | |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| Microscope for micro-injection | Olympus | SZ61 | |
| Microscope light source | Olympus | KL 1600 LED | |
| Mineral oil | Sigma | M3516 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| Mouse anti- β-actin-HRP | Sigma | A3854 | 1:20000 (WB) |
| Mouse anti-HaloTag | Promega | G921A | 1:500 (IF) |
| Multi-mode reader | BioTek Instruments | Cytation 5 | |
| Nucleic acid agarose gel electrophoresis apparatus | Biorad | Mini-Sub Cell GT Systems | |
| Oligo(dT)20 | Integrated DNA Technologies | customized: (dT)20 | |
| Orange G | Sigma | O3756 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 14190144 | |
| pCS2+8 Halo-2XHA-P2A-TeV-Keap1-2xHA | self-cloned | – | Available from Prof. Yimon AYE's group at EPFL |
| pCS2+8 Halo-TeV-Keap1-2xHA | self-cloned | – | Available from Prof. Yimon AYE's group at EPFL |
| Pneumatic PicoPump | WPI | SYS-PV820 | |
| Protein electrophoresis equipment and supplies | Biorad | Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis | |
| Rabbit anti-active Caspase-3 | BD Pharmingen | 559565 | 1:800 (IF) |
| Rat anti-HA-HRP | Sigma | H3663 | 1:500 (IF and WB) |
| Rat anti-RFP | ChromoTek | 5F8 | 1:800 (IF) |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| RNAseOUT recombinant ribonuclease inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| RnaseZap RNA decontamination solution | ThermoFisher Scientific | AM9780 | |
| Rocking Shaker | DLAB | SK-R1807-S | |
| SDS | Teknova | S9974 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080085 | |
| t-Butanol | Sigma | 471712 | |
| TCEP-HCl | Gold Biotechnology | TCEP1 | |
| TeV protease (S219V) | self-made | – | Parvez, S. et al. T-REX on-demand redox targeting in live cells. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016). |
| Tg(lyz:TagRFP) | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | uwm11Tg (ZFIN) | – |
| Tg(mpeg1:eGFP) | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | gl22Tg (ZFIN) | – |
| Thermal cycler | Analytik Jana | 846-x-070-280 | |
| TMEDA | Sigma | T7024 | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-9D | |
| Tris | Apollo | APOBI2888 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma | T9003 | |
| Tween 20 | Fisher | BP337-500 | |
| UV lamp with 365-nm light | Spectroline | ENF 240C | |
| UV meter | Spectroline | XS-365 | |
| Vortexer | Scientific Industries, Inc. | Vortex-Genie 2 | |
| Western Blotting Transfer equipment and supplies | Biorad | Mini Trans-Blot or Criterion Blotter | |
| Zebrafish husbandry and breeding equipment | in house | ||
| Zirconia beads | BioSpec | 11079107zx |
References
- Long, M. J. C., Ly, P., Aye, Y. A primer on harnessing non-enzymatic post-translational modifications for drug design. RSC Medicinal Chemistry. 12 (11), 1797-1807 (2021).
- Parvez, S., Long, M. J. C., Poganik, J. R., Aye, Y. Redox signaling by reactive electrophiles and oxidants. Chemical Reviews. 118 (18), 8798-8888 (2018).
- Parvez, S., et al. T-REX on-demand redox targeting in live cells. Nature Protocols. 11 (12), 2328-2356 (2016).
- Long, M. J. C., et al. Precision electrophile tagging in Caenorhabditis elegans. Biochemistry. 57 (2), 216-220 (2018).
- Van Hall-Beauvais, A., Zhao, Y., Urul, D. A., Long, M. J. C., Aye, Y. Single-protein-specific redox targeting in live mammalian cells and C. elegans. Current Protocols in Chemical Biology. 10 (3), 43 (2018).
- Long, M. J. C., et al. Akt3 is a privileged first responder in isozyme-specific electrophile response. Nature Chemical Biology. 13 (3), 333-338 (2017).
- Poganik, J. R., et al. Wdr1 and cofilin are necessary mediators of immune-cell-specific apoptosis triggered by Tecfidera. Nature Communications. 12 (1), 5736 (2021).
- Lin, H. -. Y., Haegele, J. A., Disare, M. T., Lin, Q., Aye, Y. A generalizable platform for interrogating target- and signal-specific consequences of electrophilic modifications in redox-dependent cell signaling. Journal of the American Chemical Society. 137 (19), 6232-6244 (2015).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Wakabayashi, N., et al. Keap1-null mutation leads to postnatal lethality due to constitutive Nrf2 activation. Nature Genetics. 35 (3), 238-245 (2003).
- Huang, K. -. T., et al. Z-REX: Shepherding reactive electrophiles to specific proteins expressed either tissue-specifically or ubiquitously, and recording the resultant functional electrophile-induced redox responses in larval fish. Nature Protocols. , (2023).
- Long, M. J. C., Assari, M., Aye, Y. Hiding in plain sight: The issue of hidden variables. ACS Chemical Biology. 17 (6), 1285-1292 (2022).
