In vitro Investigación de los efectos de la matriz extracelular rica en hialuronanos en la migración de células de cresta neural
Summary
Este protocolo describe un experimento de migración in vitro adecuado para el análisis funcional de las moléculas involucradas en la migración in vivo de las células de la cresta neural a la matriz extracelular rica en hialuronano.
Abstract
Las células de la cresta neural (NCC) son células altamente migratorias que se originan en la región dorsal del tubo neural. La emigración de NCC desde el tubo neural es un proceso esencial para la producción de NCC y su posterior migración hacia los sitios objetivo. La ruta migratoria de los NCC, incluidos los tejidos del tubo neural circundantes, involucra una matriz extracelular rica en hialuronano (HA). Para modelar la migración de NCC en estos tejidos circundantes ricos en HA desde el tubo neural, se estableció en este estudio un ensayo de migración de sustrato mixto que consiste en HA (peso molecular promedio: 1,200-1,400 kDa) y colágeno tipo I (Col1). Este ensayo de migración demuestra que las células de línea celular NCC, O9-1, son altamente migratorias en el sustrato mixto y que el recubrimiento de HA se degrada en el sitio de adherencias focales en el curso de la migración. Este modelo in vitro puede ser útil para una mayor exploración de la base mecanicista involucrada en la migración de NCC. Este protocolo también es aplicable para evaluar diferentes sustratos como andamios para estudiar la migración de NCC.
Introduction
Las células de la cresta neural (NCC) son una población celular multipotente que está presente en los embriones en desarrollo, y se originan en el borde de la placa neural durante la neurulación. Contribuyen a la formación de una variedad de tejidos, incluyendo el sistema nervioso periférico, el sistema cardiovascular, los tejidos craneofaciales y el esqueleto1. Después de la inducción y la especificación de NCC en el borde de la placa neural, los NCC emigran del neuroepitelio y migran hacia los sitios de tejido derivados de NCC1.
El hialuronano (HA) es un glicosaminoglicano no sulfatado que se distribuye en una variedad de tejidos como un componente de la matriz extracelular (ECM). La importancia de HA en el desarrollo embrionario se ha demostrado en sistemas modelo a través de la ablación de genes responsables del metabolismo de los hialuronanos. Por ejemplo, se encontró que las mutaciones en los genes de la hialuronano sintasa (Has1 y Has2) en Xenopus conducen a defectos de migración NCC y malformación craneofacial2. Además, se ha informado que los proteoglicanos de unión a HA, agrecano y versicano, ejercen efectos inhibitorios sobre la migración de NCC3. En ratones, la ablación de Has2 conduce a defectos graves en la formación del cojín endocárdico, lo que resulta en la letalidad a mediados de la gestación (E9.5-10) 4,5,6.
Se ha demostrado recientemente que la proteína transmembrana 2 (Tmem2), una hialuronidasa de superficie celular, desempeña un papel crítico en la promoción de la adhesión y migración de células cancerosas mediada por integrina mediante la eliminación de HA asociada a la matriz en los sitios de adhesión 7,8. Más recientemente, Inubushi et al.9 demostraron que una deficiencia en Tmem2 conduce a defectos craneofaciales graves debido a anomalías en la emigración/migración y supervivencia de NCC. En el estudio anterior9, la expresión de Tmem2 se analizó durante la formación y migración de NCC. La expresión de Tmem2 se observó en el sitio de la delaminación de NCC y en la emigración de NCC positivos para Sox9 (Figura 1). Además, utilizando células de la cresta neural O9-1 de ratón sin Tmem2, el estudio demostró que la expresión in vitro de Tmem2 era esencial para que las células O9-1 formaran adherencias focales y para su migración a sustratos que contienen HA (Figura 2 y Figura 3)9.
Estos resultados indican fuertemente que Tmem2 también es importante para la adhesión y migración de NCC a través de la ECM rica en HA. Sin embargo, el mecanismo molecular de adhesión y migración de NCC dentro de la ECM rica en HA aún no está claro. Por lo tanto, es necesario establecer un sistema experimental de cultivo in vitro para explorar completamente la adhesión y migración de NCC dentro de la ECM rica en HA.
De los numerosos enfoques empleados en la prueba de la migración celular, el ensayo basado en el cierre de heridas celulares es un método simple utilizado con frecuencia en los campos de la fisiología y la oncología10. Este enfoque es útil debido a su relevancia para el fenotipo in vivo y es eficaz para determinar el papel de fármacos y quimioatrayentes durante la migración celular11. Es posible evaluar la capacidad de migración tanto de masas celulares enteras como de células individuales midiendo las distancias de brecha celular a lo largo del tiempo11. En este manuscrito, se introduce un ensayo modificado in vitro basado en el cierre de heridas para modelar la migración de NCC en tejidos ricos en HA que rodean el tubo neural. Este procedimiento también es aplicable para estudiar diferentes componentes de ECM (es decir, colágenos, fibronectina y laminina) para analizar el papel del andamio de ECM en la migración de NCC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Varios componentes de ECM regulan la emigración/migración de NCC. Por ejemplo, la HA regula positivamente la migración de NCC 2,15. Curiosamente, un estudio basado en modelos genéticos de ratón de Tmem2, una hialuronidasa de superficie celular, elucidó el requisito de degradación de HA en la migración de NCC9. Los colágenos también son abundantes en la ECM que rodea el tubo neural16. Se ha demostrado que l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Expreso un gran agradecimiento a Fumitoshi Irie y Yu Yamaguchi por su aliento y amables sugerencias para establecer este método. Este trabajo fue apoyado por subvenciones para programas de investigación científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (#19KK0232 a T.I., #20H03896 a T.I.). El método original para el recubrimiento de HA sobre sustratos de vidrio y ensayos de degradación de HA in situ en los sustratos se describió en Yamamoto et al. (2017)8, mientras que el método para la preparación de sustratos mixtos de HA/Col1 se describió en Irie et al. (2021)7.
Materials
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
