Summary

في المختبر التحقيق في آثار المصفوفة خارج الخلية الغنية بالهيالورونان على هجرة خلايا القمة العصبية

Published: February 10, 2023
doi:

Summary

يحدد هذا البروتوكول تجربة الهجرة في المختبر المناسبة للتحليل الوظيفي للجزيئات المشاركة في الهجرة في الجسم الحي لخلايا القمة العصبية إلى المصفوفة خارج الخلية الغنية بالهيالورونان.

Abstract

خلايا القمة العصبية (NCCs) هي خلايا شديدة الارتحال تنشأ من المنطقة الظهرية للأنبوب العصبي. تعد هجرة الخلايا الخيطية من الأنبوب العصبي عملية أساسية لإنتاج NCC وهجرتها اللاحقة نحو المواقع المستهدفة. يتضمن مسار هجرة NCCs ، بما في ذلك أنسجة الأنبوب العصبي المحيطة ، مصفوفة خارج الخلية غنية بالهيالورونان (HA). لنمذجة هجرة NCC إلى هذه الأنسجة المحيطة الغنية ب HA من الأنبوب العصبي ، تم إنشاء اختبار هجرة الركيزة المختلطة الذي يتكون من HA (متوسط الوزن الجزيئي: 1,200-1,400 kDa) والكولاجين من النوع الأول (Col1) في هذه الدراسة. يوضح اختبار الهجرة هذا أن خلايا خط خلايا NCC ، O9-1 ، مهاجرة للغاية على الركيزة المختلطة وأن طلاء HA يتحلل في موقع الالتصاقات البؤرية أثناء الهجرة. يمكن أن يكون هذا النموذج في المختبر مفيدا لمزيد من الاستكشاف للأساس الميكانيكي الذي ينطوي عليه هجرة NCC. ينطبق هذا البروتوكول أيضا على تقييم ركائز مختلفة كسقالات لدراسة هجرة NCC.

Introduction

خلايا القمة العصبية (NCCs) هي مجموعة خلايا متعددة القدرات موجودة في الأجنة النامية ، وتنشأ من حدود الصفيحة العصبية أثناء العصبية. أنها تسهم في تشكيل مجموعة متنوعة من الأنسجة ، بما في ذلك الجهاز العصبي المحيطي ، ونظام القلب والأوعية الدموية ، والأنسجة القحفية الوجهية ، والهيكل العظمي1. بعد الحث ومواصفات NCC على حدود الصفيحة العصبية ، تهاجر NCCs من الظهارة العصبية وتهاجر نحو مواقع الأنسجة المشتقة من NCC1.

الهيالورونان (HA) هو جليكوزامينوجليكان غير كبريتي يتم توزيعه في مجموعة متنوعة من الأنسجة كمكون للمصفوفة خارج الخلية (ECM). تم إثبات أهمية HA في تطور الجنين في الأنظمة النموذجية من خلال استئصال الجينات المسؤولة عن استقلاب الهيالورونان. على سبيل المثال ، تم العثور على طفرات في جينات سينسيز الهيالورونان (Has1 و Has2) في Xenopus تؤدي إلى عيوب هجرة NCC والتشوه القحفيالوجهي 2. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن أن البروتيوغليكان المرتبط ب HA ، aggrecan و versican ، يمارس تأثيرات مثبطة على هجرة NCC3. في الفئران ، يؤدي الاجتثاث Has2 إلى عيوب شديدة في تكوين وسادة الشغاف ، مما يؤدي إلى فتك منتصف الحمل (E9.5-10)4،5،6.

ثبت مؤخرا أن البروتين عبر الغشاء 2 (Tmem2) ، وهو هيالورونيداز سطح الخلية ، يلعب دورا مهما في تعزيز التصاق الخلايا السرطانية بوساطة الأنتغرين وهجرتها عن طريق إزالة HA المرتبط بالمصفوفة في مواقع الالتصاق 7,8. في الآونة الأخيرة ، أظهر Inubushi et al.9 أن نقص Tmem2 يؤدي إلى عيوب قحفية وجهية شديدة بسبب تشوهات في هجرة / هجرة NCC والبقاء على قيد الحياة. في الدراسة السابقة9 ، تم تحليل تعبير Tmem2 أثناء تكوين NCC والهجرة. لوحظ تعبير Tmem2 في موقع تفريغ NCC وفي هجرة NCCs الإيجابية Sox9 (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام خلايا القمة العصبية للفأر المستنفد Tmem2 O9-1 ، أظهرت الدراسة أن التعبير في المختبر ل Tmem2 كان ضروريا لخلايا O9-1 لتشكيل التصاقات بؤرية وهجرتها إلى ركائز تحتوي على HA (الشكل 2 والشكل 3) 9.

تشير هذه النتائج بقوة إلى أن Tmem2 مهم أيضا لالتصاق NCC والانتقال من خلال ECM الغني ب HA. ومع ذلك ، فإن الآلية الجزيئية لالتصاق NCC والهجرة داخل ECM الغنية ب HA لا تزال غير واضحة. لذلك ، من الضروري إنشاء نظام تجريبي للثقافة في المختبر لاستكشاف التصاق NCC والهجرة بشكل كامل داخل ECM الغني ب HA.

من بين الأساليب العديدة المستخدمة في اختبار هجرة الخلايا ، فإن الفحص القائم على إغلاق جرح الخلية هو طريقة بسيطة تستخدم بشكل متكرر في مجالات علم وظائف الأعضاء والأورام10. هذا النهج مفيد بسبب صلته بالنمط الظاهري في الجسم الحي وهو فعال في تحديد أدوار الأدوية والجاذبات الكيميائية أثناء هجرة الخلايا11. من الممكن تقييم قدرة الهجرة لكل من كتل الخلايا الكاملة والخلايا الفردية عن طريق قياس مسافات فجوة الخلية بمرور الوقت11. في هذه المخطوطة ، تم تقديم اختبار معدل قائم على إغلاق الجروح في المختبر لنموذج هجرة NCC إلى الأنسجة الغنية ب HA المحيطة بالأنبوب العصبي. ينطبق هذا الإجراء أيضا على دراسة مكونات ECM المختلفة (مثل الكولاجين والفبرونيكتين واللامينين) لتحليل دور سقالة ECM في هجرة NCC.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في كلية الدراسات العليا لطب الأسنان بجامعة أوساكا. 1. ثقافة خلايا قمة الجمجمة العصبية الفأر ملاحظة: يتكون خط خلايا القمة العصبية المستخدم في هذه الدراسة من خلايا O9-1 ، المشتقة أصلا من Wnt1-Cre<…

Representative Results

تم إجراء اختبار الهجرة على ركائز مختلطة تتكون من Col1 والوزن الجزيئي العالي HA (متوسط الوزن الجزيئي: 1,200-1,400 كيلو دالتون) باستخدام البروتوكول الموضح هنا. تم العثور على خلايا O9-1 عند حدود الفجوة تهاجر بسهولة إلى الفجوة الغنية ب HA (الشكل 4). أكد التلوين المناعي لعلامة FA ، vinculin<sup class="…

Discussion

تنظم مكونات ECM المختلفة الهجرة / الهجرة NCC. على سبيل المثال ، ينظم HA بشكل إيجابي ترحيل NCC 2,15. ومن المثير للاهتمام ، أن دراسة تستند إلى نماذج الفئران الجينية ل Tmem2 ، وهو هيالورونيداز سطح الخلية ، أوضحت متطلبات تدهور HA في هجرة NCC9. الكولاجين وفير أيضا ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

أعرب عن تقديري الكبير لفوميتوشي إيري ويو ياماغوتشي لتشجيعهما واقتراحاتهما الطيبة في إنشاء هذه الطريقة. تم دعم هذا العمل من خلال المنح المساعدة لبرامج البحث العلمي من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (#19KK0232 إلى TI ، #20H03896 إلى T.I.). تم وصف الطريقة الأصلية لطلاء HA على ركائز زجاجية ومقايسات تحلل HA في الموقع على الركائز في Yamamoto et al. (2017) 8 ، بينما تم وصف طريقة تحضير ركائز HA / Col1 المختلطة في Irie et al. (2021) 7.

Materials

10cm cell culture dish CORNING Cat. 353003
1X PBS Millipore Cat. No. BSS-1005-B
2-well culture inserts ibidi Cat. No. 80209
Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG Invitrogen Cat. A21422 Goat derived anti-mouse secondary antibody
automated cell counter Bio-Rad Cat. No. TC20
CELLBANKER ZENOGEN PHARMA Cat. 11910 Cell freezing medium
collagen type I Sigma Cat. No. 08-115
Complete ES Cell Medium Millipore Cat. No. ES-101-B
DAPI Invitrogen Cat. 10184322
Dulbecco’s Modified Eagle Medium  Gibco Cat. 11971025
Fetal Bovine serum Gibco Cat. 10270106
fluorescence microscope Keyence Cat. No. BZ-X700
Fluoresent labelled HA PG Research FAHA-H2
Glas bottom dish Iwaki Cat. 11-0602
glutaldehyde Sigma Cat. No. G5882
Matrigel Fisher Cat. No. CB-40234 The basement-membrane matrix
monoclonal anti-vinculin antibody Sigma Cat. No. V9264
mounting media Dako S3023
Normal goat serum Fisher Cat. 50062Z
O9-1 cells Millipore Cat. No. SCC049
Paraformaldehyde Sigma Cat. 158127
triethoxysilane Sigma Cat. No. 390143
trypsin-EDTA Millipore Cat. No. SM-2003-C

References

  1. Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
  2. Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
  3. Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
  4. Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
  5. Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
  6. Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
  7. Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
  8. Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
  9. Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
  10. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  11. Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
  12. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  13. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
  14. Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
  15. Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
  16. Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
  17. Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
  18. Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).
  19. Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
  20. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  21. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  22. Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
  23. Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
  24. Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
  25. Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).

Play Video

Cite This Article
Inubushi, T. In Vitro Investigation of the Effects of the Hyaluronan-Rich Extracellular Matrix on Neural Crest Cell Migration. J. Vis. Exp. (192), e64749, doi:10.3791/64749 (2023).

View Video