يحدد هذا البروتوكول تجربة الهجرة في المختبر المناسبة للتحليل الوظيفي للجزيئات المشاركة في الهجرة في الجسم الحي لخلايا القمة العصبية إلى المصفوفة خارج الخلية الغنية بالهيالورونان.
خلايا القمة العصبية (NCCs) هي خلايا شديدة الارتحال تنشأ من المنطقة الظهرية للأنبوب العصبي. تعد هجرة الخلايا الخيطية من الأنبوب العصبي عملية أساسية لإنتاج NCC وهجرتها اللاحقة نحو المواقع المستهدفة. يتضمن مسار هجرة NCCs ، بما في ذلك أنسجة الأنبوب العصبي المحيطة ، مصفوفة خارج الخلية غنية بالهيالورونان (HA). لنمذجة هجرة NCC إلى هذه الأنسجة المحيطة الغنية ب HA من الأنبوب العصبي ، تم إنشاء اختبار هجرة الركيزة المختلطة الذي يتكون من HA (متوسط الوزن الجزيئي: 1,200-1,400 kDa) والكولاجين من النوع الأول (Col1) في هذه الدراسة. يوضح اختبار الهجرة هذا أن خلايا خط خلايا NCC ، O9-1 ، مهاجرة للغاية على الركيزة المختلطة وأن طلاء HA يتحلل في موقع الالتصاقات البؤرية أثناء الهجرة. يمكن أن يكون هذا النموذج في المختبر مفيدا لمزيد من الاستكشاف للأساس الميكانيكي الذي ينطوي عليه هجرة NCC. ينطبق هذا البروتوكول أيضا على تقييم ركائز مختلفة كسقالات لدراسة هجرة NCC.
خلايا القمة العصبية (NCCs) هي مجموعة خلايا متعددة القدرات موجودة في الأجنة النامية ، وتنشأ من حدود الصفيحة العصبية أثناء العصبية. أنها تسهم في تشكيل مجموعة متنوعة من الأنسجة ، بما في ذلك الجهاز العصبي المحيطي ، ونظام القلب والأوعية الدموية ، والأنسجة القحفية الوجهية ، والهيكل العظمي1. بعد الحث ومواصفات NCC على حدود الصفيحة العصبية ، تهاجر NCCs من الظهارة العصبية وتهاجر نحو مواقع الأنسجة المشتقة من NCC1.
الهيالورونان (HA) هو جليكوزامينوجليكان غير كبريتي يتم توزيعه في مجموعة متنوعة من الأنسجة كمكون للمصفوفة خارج الخلية (ECM). تم إثبات أهمية HA في تطور الجنين في الأنظمة النموذجية من خلال استئصال الجينات المسؤولة عن استقلاب الهيالورونان. على سبيل المثال ، تم العثور على طفرات في جينات سينسيز الهيالورونان (Has1 و Has2) في Xenopus تؤدي إلى عيوب هجرة NCC والتشوه القحفيالوجهي 2. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن أن البروتيوغليكان المرتبط ب HA ، aggrecan و versican ، يمارس تأثيرات مثبطة على هجرة NCC3. في الفئران ، يؤدي الاجتثاث Has2 إلى عيوب شديدة في تكوين وسادة الشغاف ، مما يؤدي إلى فتك منتصف الحمل (E9.5-10)4،5،6.
ثبت مؤخرا أن البروتين عبر الغشاء 2 (Tmem2) ، وهو هيالورونيداز سطح الخلية ، يلعب دورا مهما في تعزيز التصاق الخلايا السرطانية بوساطة الأنتغرين وهجرتها عن طريق إزالة HA المرتبط بالمصفوفة في مواقع الالتصاق 7,8. في الآونة الأخيرة ، أظهر Inubushi et al.9 أن نقص Tmem2 يؤدي إلى عيوب قحفية وجهية شديدة بسبب تشوهات في هجرة / هجرة NCC والبقاء على قيد الحياة. في الدراسة السابقة9 ، تم تحليل تعبير Tmem2 أثناء تكوين NCC والهجرة. لوحظ تعبير Tmem2 في موقع تفريغ NCC وفي هجرة NCCs الإيجابية Sox9 (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام خلايا القمة العصبية للفأر المستنفد Tmem2 O9-1 ، أظهرت الدراسة أن التعبير في المختبر ل Tmem2 كان ضروريا لخلايا O9-1 لتشكيل التصاقات بؤرية وهجرتها إلى ركائز تحتوي على HA (الشكل 2 والشكل 3) 9.
تشير هذه النتائج بقوة إلى أن Tmem2 مهم أيضا لالتصاق NCC والانتقال من خلال ECM الغني ب HA. ومع ذلك ، فإن الآلية الجزيئية لالتصاق NCC والهجرة داخل ECM الغنية ب HA لا تزال غير واضحة. لذلك ، من الضروري إنشاء نظام تجريبي للثقافة في المختبر لاستكشاف التصاق NCC والهجرة بشكل كامل داخل ECM الغني ب HA.
من بين الأساليب العديدة المستخدمة في اختبار هجرة الخلايا ، فإن الفحص القائم على إغلاق جرح الخلية هو طريقة بسيطة تستخدم بشكل متكرر في مجالات علم وظائف الأعضاء والأورام10. هذا النهج مفيد بسبب صلته بالنمط الظاهري في الجسم الحي وهو فعال في تحديد أدوار الأدوية والجاذبات الكيميائية أثناء هجرة الخلايا11. من الممكن تقييم قدرة الهجرة لكل من كتل الخلايا الكاملة والخلايا الفردية عن طريق قياس مسافات فجوة الخلية بمرور الوقت11. في هذه المخطوطة ، تم تقديم اختبار معدل قائم على إغلاق الجروح في المختبر لنموذج هجرة NCC إلى الأنسجة الغنية ب HA المحيطة بالأنبوب العصبي. ينطبق هذا الإجراء أيضا على دراسة مكونات ECM المختلفة (مثل الكولاجين والفبرونيكتين واللامينين) لتحليل دور سقالة ECM في هجرة NCC.
تنظم مكونات ECM المختلفة الهجرة / الهجرة NCC. على سبيل المثال ، ينظم HA بشكل إيجابي ترحيل NCC 2,15. ومن المثير للاهتمام ، أن دراسة تستند إلى نماذج الفئران الجينية ل Tmem2 ، وهو هيالورونيداز سطح الخلية ، أوضحت متطلبات تدهور HA في هجرة NCC9. الكولاجين وفير أيضا ?…
The authors have nothing to disclose.
أعرب عن تقديري الكبير لفوميتوشي إيري ويو ياماغوتشي لتشجيعهما واقتراحاتهما الطيبة في إنشاء هذه الطريقة. تم دعم هذا العمل من خلال المنح المساعدة لبرامج البحث العلمي من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (#19KK0232 إلى TI ، #20H03896 إلى T.I.). تم وصف الطريقة الأصلية لطلاء HA على ركائز زجاجية ومقايسات تحلل HA في الموقع على الركائز في Yamamoto et al. (2017) 8 ، بينما تم وصف طريقة تحضير ركائز HA / Col1 المختلطة في Irie et al. (2021) 7.
10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
mounting media | Dako | S3023 | |
Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |