In vitro Investigação dos Efeitos da Matriz Extracelular Rica em Hialuronano na Migração de Células da Crista Neural

As células da crista neural (NCCs) são uma população celular multipotente que está presente em embriões em desenvolvimento, e se originam da borda da placa neural durante a neurulação. Contribuem para a formação de uma variedade de tecidos, incluindo o sistema nervoso periférico, o sistema cardiovascular, os tecidos craniofaciais e o esqueleto1^. Após indução e especificação da NCC na borda da placa neural, as NCCs emigram do neuroepitélio e migram para sítios teciduais derivados da NCC¹.

O hialuronano (AH) é um glicosaminoglicano não sulfatado que se distribui em uma variedade de tecidos como componente da matriz extracelular (MEC). A importância do AH no desenvolvimento embrionário tem sido demonstrada em sistemas modelo através da ablação de genes responsáveis pelo metabolismo do hialuronano. Por exemplo, mutações nos genes hialuronano sintase (Has1 e Has2) em Xenopus levaram a defeitos de migração de NCC e malformação craniofacial2. Além disso, os proteoglicanos ligantes de AH, agrecan e versican, têm sido relatados como exercendo efeitos inibitórios sobre a migração de NCC³. Em camundongos, a ablação de Has2 leva a graves defeitos na formação do coxim endocárdico, resultando em letalidade no meio da gestação (E9,5-10)^4,5,6.

A proteína transmembrana 2 (Tmem2), uma hialuronidase de superfície celular, demonstrou recentemente desempenhar um papel crítico na promoção da adesão e migração de células cancerosas mediadas por integrinas, removendo o AH associado à matriz nos sítios de adesão ^7,8. Mais recentemente, Inubushi et ^al.9 demonstraram que a deficiência de Tmem2 leva a graves defeitos craniofaciais devido a anormalidades na emigração/migração e sobrevida das NCC. No estudo anterior⁹, a expressão de Tmem2 foi analisada durante a formação e migração de NCC. A expressão de Tmem2 foi observada no local de delaminação de NCC e em NCCs Sox9-positivos emigrados (Figura 1). Além disso, utilizando células da crista neural O9-1 de camundongos depletadas de Tmem2, o estudo demonstrou que a expressão in vitro de Tmem2 foi essencial para que as células O9-1 formassem aderências focais e para sua migração para substratos contendo AH (Figura 2 e Figura 3)⁹.

Esses resultados indicam fortemente que o Tmem2 também é importante para a adesão e migração do NCC através da MEC rica em AH. No entanto, o mecanismo molecular de adesão e migração de NCC dentro da MEC rica em AH ainda não está claro. Portanto, é necessário estabelecer um sistema experimental de cultivo in vitro para explorar completamente a adesão e migração de NCC dentro da MEC rica em AH.

Das inúmeras abordagens empregadas no teste da migração celular, o ensaio baseado no fechamento de feridas celulares é um método simples e frequentemente utilizado nos campos da fisiologia e^oncologia10. Essa abordagem é útil devido à sua relevância para o fenótipo in vivo e é eficaz na determinação do papel de drogas e quimioatrativos durante a migração celular¹¹. É possível avaliar a capacidade de migração tanto de massas celulares inteiras quanto de células individuais medindo as distâncias de gap celular ao longo do tempo¹¹. Neste manuscrito, um ensaio modificado in vitro baseado no fechamento de feridas é introduzido para modelar a migração de NCC para tecidos ricos em AH ao redor do tubo neural. Esse procedimento também é aplicável para estudar diferentes componentes da MEC (i.e., colágenos, fibronectina e laminina) para analisar o papel do arcabouço da MEC na migração da NCC.