במבחנה חקר ההשפעות של מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן על נדידת תאי קרסט עצביים
Summary
פרוטוקול זה מתאר ניסוי נדידה חוץ גופית המתאים לניתוח פונקציונלי של המולקולות המעורבות בנדידת in vivo של תאי פסגה עצבית לתוך מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן.
Abstract
תאי פסגה עצבית (NCCs) הם תאים נודדים מאוד שמקורם באזור הגבי של הצינור העצבי. הגירה של NCCs מן הצינור העצבי הוא תהליך חיוני לייצור NCC ואת ההגירה שלהם לאחר מכן לעבר אתרי המטרה. מסלול הנדידה של NCCs, כולל רקמות הצינור העצבי שמסביב, כולל מטריצה חוץ-תאית עשירה בהיאלורונן (HA). כדי למדל נדידת NCC לתוך הרקמות הסובבות העשירות בחומצה היאלורונית מהצינור העצבי, הוקמה במחקר זה בדיקת נדידת מצע מעורבת המורכבת מחומצה היאלורונית (משקל מולקולרי ממוצע: 1,200-1,400 kDa) וקולגן מסוג I (Col1). בדיקת נדידה זו מראה כי תאי קו תאי NCC, O9-1, נודדים מאוד על המצע המעורב וכי ציפוי החומצה ההיאלורונית מתפרק באתר של הידבקויות מוקדיות במהלך הנדידה. מודל זה במבחנה יכול להיות שימושי לחקירה נוספת של הבסיס המכניסטי המעורב בהגירה של NCC. פרוטוקול זה ישים גם להערכת מצעים שונים כפיגומים לחקר נדידת NCC.
Introduction
תאי קרסט עצביים (Neural crest cells או NCCs) הם אוכלוסיית תאים רב-פוטנטית הקיימת בעוברים מתפתחים, והם מקורם בגבול הצלחת העצבית במהלך הנוירולציה. הם תורמים להיווצרות של מגוון רקמות, כולל מערכת העצבים ההיקפית, מערכת הלב וכלי הדם, רקמות craniofacial ואת השלד1. לאחר אינדוקציה ואפיון NCC בגבול הצלחת העצבית, NCCs מהגרים מהנוירואפיתל ונודדים לעבר אתרי רקמות שמקורם ב- NCC1.
היאלורונן (HA) הוא גליקוזאמינוגליקן ללא סולפט המופץ במגוון רקמות כמרכיב של המטריצה החוץ תאית (ECM). חשיבותה של חומצה היאלורונית בהתפתחות עוברים הודגמה במערכות מודל באמצעות אבלציה של גנים האחראים על חילוף החומרים של היאלורונן. לדוגמה, מוטציות בגנים סינתאז היאלורונן (Has1 ו- Has2) ב– Xenopus נמצאו כמובילות לפגמים בנדידת NCC ומום גולגולתי2. בנוסף, דווח כי הפרוטאוגליקנים קושרי HA, אגרקן וורסיקני, מפעילים השפעות מעכבות על נדידת NCC3. בעכברים, אבלציה Has2 מובילה לפגמים חמורים בהיווצרות כרית אנדוקרדיאלית, וכתוצאה מכך קטלניות באמצע ההיריון (E9.5-10) 4,5,6.
חלבון טרנסממברנה 2 (Tmem2), היאלורונידאז על פני התא, הוכח לאחרונה כממלא תפקיד קריטי בקידום הידבקות ונדידה של תאים סרטניים בתיווך אינטגרין על ידי הסרת חומצה היאלורונית הקשורה למטריצה באתרי ההדבקה 7,8. לאחרונה, Inubushi et al.9 הראו כי מחסור ב- Tmem2 מוביל למומים גולגולתיים חמורים עקב חריגות בהגירה / הגירה של NCC והישרדות. במחקר הקודם9, ביטוי Tmem2 נותח במהלך היווצרות והגירה של NCC. ביטוי Tmem2 נצפה באתר של דלמינציה של NCC ובהגירה של NCCs חיוביים ל-Sox9 (איור 1). נוסף על כך, באמצעות שימוש בתאי סמל עצבי O9-1 של עכבר שהתרוקן מ-Tmem2, המחקר הראה שהביטוי במבחנה של Tmem2 היה חיוני ליצירת הידבקויות מוקדיות עבור תאי O9-1 ולנדידתם למצעים המכילים HA (איור 2 ואיור 3)9.
תוצאות אלה מצביעות בבירור על כך ש- Tmem2 חשוב גם להידבקות והגירה של NCC באמצעות ECM עשיר ב- HA. עם זאת, המנגנון המולקולרי של הידבקות והגירה של NCC בתוך ECM עשיר HA עדיין לא ברור. לכן, יש צורך להקים מערכת ניסויית בתרבית חוץ גופית כדי לחקור באופן מלא הידבקות והגירה של NCC בתוך ECM עשיר HA.
מבין הגישות הרבות המשמשות לבדיקת נדידת תאים, הבדיקה המבוססת על סגירת פצעי תאים היא שיטה פשוטה המשמשת לעתים קרובות בתחומי הפיזיולוגיה והאונקולוגיה10. גישה זו שימושית בשל הרלוונטיות שלה לפנוטיפ in vivo והיא יעילה בקביעת התפקידים של תרופות וכימואטרקטנטים במהלך נדידת תאים11. ניתן להעריך את יכולת הנדידה הן של מסות תאים שלמים והן של תאים בודדים על ידי מדידת מרחקי פער התא לאורך זמן11. בכתב יד זה, מוצגת בדיקה שונה המבוססת על סגירת פצעים במבחנה כדי למדל נדידת NCC לרקמות עשירות בחומצה היאלורונית המקיפות את הצינור העצבי. הליך זה ישים גם לחקר רכיבי ECM שונים (כלומר, קולגן, פיברונקטין ולמינין) כדי לנתח את תפקיד פיגום ECM בנדידת NCC.
Protocol
Representative Results
Discussion
רכיבי ECM שונים מסדירים הגירה/הגירה של NCC. לדוגמה, HA מווסת באופן חיובי את נדידת NCC 2,15. באופן מעניין, מחקר המבוסס על מודלים גנטיים של עכברים של Tmem2, היאלורונידאז על פני התא, הבהיר את הדרישה לפירוק HA בנדידת NCC9. קולגן מצוי בשפע גם ב-ECM המקיף את הצינור העצ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אני מביע תודה רבה לפומיטושי איירי ויו ימאגוצ’י על עידודם והצעותיהם האדיבות בביסוס שיטה זו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים לתוכניות מחקר מדעי מהאגודה היפנית לקידום המדע (#19KK0232 ל- T.I., #20H03896 ל- T.I). השיטה המקורית לציפוי HA על מצעי זכוכית ומבחני פירוק HA באתרם על המצע תוארה ב- Yamamoto et al. (2017)8, ואילו השיטה להכנת מצעים מעורבים HA/Col1 תוארה ב- Irie et al. (2021)7.
Materials
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
