In vitro Onderzoek naar de effecten van de hyaluronaatrijke extracellulaire matrix op neurale topcelmigratie
Summary
Dit protocol schetst een in vitro migratie-experiment dat geschikt is voor de functionele analyse van de moleculen die betrokken zijn bij de in vivo migratie van neurale topcellen naar de hyaluronrijke extracellulaire matrix.
Abstract
Neurale topcellen (NCC’s) zijn sterk migrerende cellen die afkomstig zijn uit het dorsale gebied van de neurale buis. De emigratie van NCC’s uit de neurale buis is een essentieel proces voor NCC-productie en hun daaropvolgende migratie naar doellocaties. De migratieroute van NCC’s, inclusief de omliggende neurale buisweefsels, omvat hyaluronaat (HA) -rijke extracellulaire matrix. Om NCC-migratie in deze HA-rijke omliggende weefsels vanuit de neurale buis te modelleren, werd in deze studie een gemengde substraatmigratietest bestaande uit HA (gemiddeld molecuulgewicht: 1.200-1.400 kDa) en collageen type I (Col1) vastgesteld. Deze migratietest toont aan dat NCC-cellijn, O9-1, cellen sterk migrerend zijn op het gemengde substraat en dat de HA-coating wordt afgebroken op de plaats van focale verklevingen in de loop van de migratie. Dit in vitro model kan nuttig zijn voor verdere verkenning van de mechanistische basis die betrokken is bij NCC-migratie. Dit protocol is ook van toepassing voor het evalueren van verschillende substraten als steigers om NCC-migratie te bestuderen.
Introduction
Neurale topcellen (NCC’s) zijn een multipotente celpopulatie die aanwezig is in zich ontwikkelende embryo’s en ze zijn afkomstig van de neurale plaatrand tijdens neurulatie. Ze dragen bij aan de vorming van een verscheidenheid aan weefsels, waaronder het perifere zenuwstelsel, het cardiovasculaire systeem, craniofaciale weefsels en het skelet1. Na inductie en NCC-specificatie aan de neurale plaatrand emigreren NCC’s van het neuro-epitheel en migreren ze naar NCC-afgeleide weefsellocaties1.
Hyaluronaat (HA) is een niet-gesulfateerd glycosaminoglycaan dat in verschillende weefsels wordt verdeeld als onderdeel van de extracellulaire matrix (ECM). Het belang van HA in de ontwikkeling van embryo’s is aangetoond in modelsystemen door de ablatie van genen die verantwoordelijk zijn voor het hyaluronaatmetabolisme. Zo bleken mutaties in hyaluronaatsynthasegenen (Has1 en Has2) in Xenopus te leiden tot NCC-migratiedefecten en craniofaciale misvorming2. Bovendien is gemeld dat de HA-bindende proteoglycanen, aggrecan en versican, remmende effecten uitoefenen op NCC-migratie3. Bij muizen leidt Has2-ablatie tot ernstige defecten in de vorming van endocardiale kussens, wat resulteert in een dodelijkheid halverwege de dracht (E9,5-10) 4,5,6.
Van transmembraaneiwit 2 (Tmem2), een hyaluronidase van het celoppervlak, is onlangs aangetoond dat het een cruciale rol speelt bij het bevorderen van integrine-gemedieerde kankerceladhesie en migratie door het verwijderen van matrix-geassocieerd HA op de adhesieplaatsen 7,8. Meer recent toonden Inubushi et al.9 aan dat een tekort aan Tmem2 leidt tot ernstige craniofaciale defecten als gevolg van afwijkingen in NCC emigratie/migratie en overleving. In de vorige studie9 werd Tmem2-expressie geanalyseerd tijdens NCC-vorming en migratie. Tmem2-expressie werd waargenomen op de plaats van NCC-delaminatie en bij het emigreren van Sox9-positieve NCC’s (figuur 1). Bovendien toonde de studie, met behulp van Tmem2-uitgeputte muis O9-1 neurale topcellen, aan dat de in vitro expressie van Tmem2 essentieel was voor de O9-1-cellen om focale verklevingen te vormen en voor hun migratie naar HA-bevattende substraten (figuur 2 en figuur 3)9.
Deze resultaten geven sterk aan dat Tmem2 ook belangrijk is voor NCC-adhesie en migratie via de HA-rijke ECM. Het moleculaire mechanisme van NCC-adhesie en migratie binnen de HA-rijke ECM is echter nog steeds onduidelijk. Het is daarom noodzakelijk om een experimenteel systeem voor in vitro kweken op te zetten om de NCC-adhesie en -migratie binnen de HA-rijke ECU volledig te onderzoeken.
Van de vele benaderingen die worden gebruikt bij het testen van celmigratie, is de op celwondsluiting gebaseerde test een eenvoudige methode die vaak wordt gebruikt op het gebied van fysiologie en oncologie10. Deze benadering is nuttig vanwege de relevantie voor het in vivo fenotype en is effectief bij het bepalen van de rol van geneesmiddelen en chemoattractanten tijdens celmigratie11. Het is mogelijk om het migratievermogen van zowel hele celmassa’s als individuele cellen te evalueren door de celspleetafstanden in de loop van de tijdte meten 11. In dit manuscript wordt een gemodificeerde in vitro op wondsluiting gebaseerde test geïntroduceerd om NCC-migratie te modelleren naar HA-rijke weefsels rond de neurale buis. Deze procedure is ook van toepassing op het bestuderen van verschillende ECM-componenten (d.w.z. collageen, fibronectine en laminine) om de rol van de ECM-steiger in NCC-migratie te analyseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschillende ECM-componenten regelen NCC-emigratie/-migratie. Zo reguleert HA de NCC-migratie 2,15 positief. Interessant is dat een studie op basis van genetische muismodellen van Tmem2, een hyaluronidase van het celoppervlak, de vereiste van HA-degradatie bij NCC-migratieophelderde 9. Collageen zijn ook overvloedig aanwezig in de ECM rond de neurale buis16. Van decorine, een kleine leucine-rijke proteoglycaan, is …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ik spreek grote dank uit aan Fumitoshi Irie en Yu Yamaguchi voor hun aanmoediging en vriendelijke suggesties bij het vaststellen van deze methode. Dit werk werd ondersteund door subsidies-in-steun voor wetenschappelijke onderzoeksprogramma’s van de Japan Society for the Promotion of Science (#19KK0232 tot T.I., #20H03896 tot T.I.). De oorspronkelijke methode voor het coaten van HA op glassubstraten en in situ HA-afbraaktests op de substraten werd beschreven in Yamamoto et al. (2017)8, terwijl de methode voor de bereiding van HA/Col1 gemengde substraten werd beschreven in Irie et al. (2021)7.
Materials
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
