In vitro Untersuchung der Auswirkungen der hyaluronsäurereichen extrazellulären Matrix auf die Migration von Neuralleistenzellen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein in vitro Migrationsexperiment, das für die funktionelle Analyse der Moleküle geeignet ist, die an der in vivo Migration von Neuralleistenzellen in die hyaluronsäurereiche extrazelluläre Matrix beteiligt sind.
Abstract
Neuralleistenzellen (NCCs) sind stark wandernde Zellen, die aus der dorsalen Region des Neuralrohrs stammen. Die Auswanderung von NCCs aus dem Neuralrohr ist ein essentieller Prozess für die NCC-Produktion und deren anschließende Migration in Richtung Zielstellen. Die Migrationsroute der NCCs, einschließlich des umgebenden Neuralrohrgewebes, umfasst eine mit Hyaluronsäure (HA) reiche extrazelluläre Matrix. Um die NCC-Migration aus dem Neuralrohr in dieses HA-reiche umgebende Gewebe zu modellieren, wurde in dieser Arbeit ein Mischsubstrat-Migrationsassay bestehend aus HA (mittleres Molekulargewicht: 1.200-1.400 kDa) und Kollagen Typ I (Col1) etabliert. Dieser Migrationsassay zeigt, dass Zellen der NCC-Zelllinie, O9-1, auf dem gemischten Substrat stark migrieren und dass die HA-Beschichtung an der Stelle der fokalen Adhäsionen im Laufe der Migration abgebaut wird. Dieses In-vitro-Modell kann nützlich sein, um die mechanistischen Grundlagen der NCC-Migration weiter zu erforschen. Dieses Protokoll eignet sich auch für die Evaluierung verschiedener Substrate als Gerüste zur Untersuchung der NCC-Migration.
Introduction
Neuralleistenzellen (NCCs) sind eine multipotente Zellpopulation, die in sich entwickelnden Embryonen vorhanden ist und während der Neurulation an der Neuralplattengrenze entsteht. Sie tragen zur Bildung einer Vielzahl von Geweben bei, darunter das periphere Nervensystem, das Herz-Kreislauf-System, das kraniofaziale Gewebe und das Skelett1. Nach Induktion und NCC-Spezifizierung an der Neuralplattengrenze wandern NCCs aus dem Neuroepithel in Richtung NCC-abgeleiteter Gewebestellen1.
Hyaluronsäure (HA) ist ein nicht sulfatiertes Glykosaminoglykan, das als Bestandteil der extrazellulären Matrix (EZM) in einer Vielzahl von Geweben verteilt ist. Die Bedeutung von HA für die Embryonalentwicklung wurde in Modellsystemen durch die Ablation von Genen nachgewiesen, die für den Hyaluronstoffwechsel verantwortlich sind. So wurde beispielsweise festgestellt, dass Mutationen in den Genen der Hyaluronsäuresynthase (Has1 und Has2) in Xenopus zu NCC-Migrationsdefekten und kraniofazialen Fehlbildungenführen 2. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die HA-bindenden Proteoglykane Aggrecan und Versican eine hemmende Wirkung auf die NCC-Migration ausüben3. Bei Mäusen führt die Has2-Ablation zu schweren Defekten in der Bildung von Endokardpolstern, was zu einerLetalität in der Mitte der Schwangerschaft (E9.5-10) führt 4,5,6.
Das Transmembranprotein 2 (Tmem2), eine Hyaluronidase auf der Zelloberfläche, hat kürzlich gezeigt, dass es eine entscheidende Rolle bei der Förderung der Integrin-vermittelten Krebszelladhäsion und -migration spielt, indem Matrix-assoziierte HA an den Adhäsionsstellen entferntwird 7,8. In jüngerer Zeit zeigten Inubushi et al.9, dass ein Mangel an Tmem2 zu schweren kraniofazialen Defekten führt, die auf Anomalien bei der Auswanderung/Migration und dem Überleben von NCCs zurückzuführen sind. In der vorangegangenen Studie9 wurde die Tmem2-Expression während der NCC-Bildung und -Migration analysiert. Die Expression von Tmem2 wurde an der Stelle der NCC-Delamination und in emigrierenden Sox9-positiven NCCs beobachtet (Abbildung 1). Darüber hinaus zeigte die Studie anhand von Tmem2-depletierten O9-1-Neuralleistenzellen der Maus, dass die In-vitro-Expression von Tmem2 für die Bildung fokaler Adhäsionen der O9-1-Zellen und für ihre Migration in HA-haltige Substrate unerlässlich ist (Abbildung 2 und Abbildung 3)9.
Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass Tmem2 auch für die Adhäsion und Migration von NCCs durch das HA-reiche ECM wichtig ist. Der molekulare Mechanismus der NCC-Adhäsion und -Migration innerhalb der HA-reichen ECM ist jedoch noch unklar. Es ist daher notwendig, ein experimentelles System für In-vitro-Kulturen zu etablieren, um die Adhäsion und Migration von NCCs innerhalb der HA-reichen ECM vollständig zu untersuchen.
Von den zahlreichen Ansätzen, die zur Prüfung der Zellmigration eingesetzt werden, ist der auf Zellwundverschluss basierende Assay eine einfache Methode, die häufig in der Physiologie und Onkologie eingesetzt wird10. Dieser Ansatz ist aufgrund seiner Relevanz für den In-vivo-Phänotyp nützlich und eignet sich effektiv zur Bestimmung der Rolle von Medikamenten und Chemolockstoffen während der Zellmigration11. Es ist möglich, die Migrationsfähigkeit sowohl ganzer Zellmassen als auch einzelner Zellen zu bewerten, indem die Zellspaltabstände über die Zeit gemessen werden11. In diesem Manuskript wird ein modifizierter in vitro Wundverschluss-basierter Assay vorgestellt, um die NCC-Migration in HA-reiches Gewebe, das das Neuralrohr umgibt, zu modellieren. Dieses Verfahren eignet sich auch für die Untersuchung verschiedener EZM-Komponenten (d. h. Kollagene, Fibronektin und Laminin), um die Rolle des EZM-Gerüsts bei der NCC-Migration zu analysieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschiedene ECM-Komponenten regeln die NCC-Auswanderung/-Migration. Zum Beispiel reguliert HA die NCC-Migration positiv 2,15. Interessanterweise verdeutlichte eine Studie, die auf genetischen Mausmodellen von Tmem2, einer Zelloberflächen-Hyaluronidase, basierte, die Notwendigkeit des HA-Abbaus bei der NCC-Migration9. Kollagene sind auch in der EZM, die das Neuralrohr umgibt, reichlich vorhanden16. Decorin, ein kle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ich bedanke mich bei Fumitoshi Irie und Yu Yamaguchi für ihre Ermutigung und ihre freundlichen Vorschläge bei der Etablierung dieser Methode. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse für wissenschaftliche Forschungsprogramme der Japan Society for the Promotion of Science (#19KK0232 to T.I., #20H03896 to T.I.) unterstützt. Die ursprüngliche Methode zur Beschichtung von HA auf Glassubstraten und in situ HA-Abbauassays auf den Substraten wurde in Yamamoto et al. (2017)8 beschrieben, während die Methode zur Herstellung von HA/Col1-Mischsubstraten in Irie et al. (2021)7 beschrieben wurde.
Materials
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
