In vitro Étude des effets de la matrice extracellulaire riche en hyaluronanes sur la migration des cellules de la crête neurale
Summary
Ce protocole décrit une expérience de migration in vitro adaptée à l’analyse fonctionnelle des molécules impliquées dans la migration in vivo des cellules de la crête neurale dans la matrice extracellulaire riche en hyaluronane.
Abstract
Les cellules de la crête neurale (CCN) sont des cellules hautement migratrices qui proviennent de la région dorsale du tube neural. L’émigration des NCC du tube neural est un processus essentiel pour la production de NCC et leur migration ultérieure vers les sites cibles. La voie migratoire des NCC, y compris les tissus environnants du tube neural, implique une matrice extracellulaire riche en hyaluronane (HA). Pour modéliser la migration des NCC dans ces tissus environnants riches en HA à partir du tube neural, un test de migration de substrat mixte composé d’HA (poids moléculaire moyen: 1 200-1 400 kDa) et de collagène de type I (Col1) a été établi dans cette étude. Ce test de migration démontre que les cellules de la lignée cellulaire NCC, O9-1, sont hautement migratrices sur le substrat mixte et que le revêtement HA est dégradé au site des adhérences focales au cours de la migration. Ce modèle in vitro peut être utile pour explorer davantage la base mécaniste impliquée dans la migration des CCN. Ce protocole est également applicable à l’évaluation de différents substrats comme échafaudages pour étudier la migration NCC.
Introduction
Les cellules de la crête neurale (CCN) sont une population cellulaire multipotente présente dans les embryons en développement, et elles proviennent de la bordure de la plaque neurale pendant la neurulation. Ils contribuent à la formation d’une variété de tissus, y compris le système nerveux périphérique, le système cardiovasculaire, les tissus craniofaciaux et le squelette1. Après induction et spécification NCC à la frontière de la plaque neurale, les NCC émigrent du neuroépithélium et migrent vers les sites tissulaires dérivés de NCC1.
L’hyaluronane (HA) est un glycosaminoglycane non sulfaté qui est distribué dans une variété de tissus en tant que composant de la matrice extracellulaire (ECM). L’importance de l’AH dans le développement de l’embryon a été démontrée dans des systèmes modèles par l’ablation des gènes responsables du métabolisme de l’hyaluronane. Par exemple, des mutations dans les gènes de la hyaluronane synthase (Has1 et Has2) chez Xenopus se sont avérées entraîner des défauts de migration NCC et une malformation craniofaciale2. De plus, il a été rapporté que les protéoglycanes se liant à l’HA, aggrécan et versican, exercent des effets inhibiteurs sur la migration NCC3. Chez la souris, l’ablation Has2 entraîne de graves défauts dans la formation du coussin endocardique, entraînant une létalité 4,5,6 en milieu de gestation (E9.5-10).
Il a récemment été démontré que la protéine transmembranaire 2 (Tmem2), une hyaluronidase de surface cellulaire, joue un rôle essentiel dans la promotion de l’adhésion et de la migration des cellules cancéreuses médiées par l’intégrine en éliminant l’AH associée à la matrice aux sites d’adhésion 7,8. Plus récemment, Inubushi et coll.9 ont démontré qu’une déficience en Tmem2 entraîne de graves anomalies craniofaciales dues à des anomalies de l’émigration/migration et de la survie des CCN. Dans l’étude précédente9, l’expression de Tmem2 a été analysée pendant la formation et la migration de NCC. L’expression de Tmem2 a été observée sur le site de délaminage des NCC et chez les NCC positifs pour Sox9 en émigration (Figure 1). De plus, en utilisant des cellules de crête neurale de souris O9-1 appauvries en Tmem2, l’étude a démontré que l’expression in vitro de Tmem2 était essentielle pour que les cellules O9-1 forment des adhérences focales et pour leur migration dans des substrats contenant de l’HA (Figure 2 et Figure 3)9.
Ces résultats indiquent fortement que Tmem2 est également important pour l’adhésion et la migration des CCN par l’intermédiaire de l’ECM riche en HA. Cependant, le mécanisme moléculaire de l’adhésion et de la migration des NCC au sein de l’ECM riche en HA n’est toujours pas clair. Il est donc nécessaire d’établir un système expérimental de culture in vitro pour explorer pleinement l’adhésion et la migration des NCC au sein de la MCE riche en HA.
Parmi les nombreuses approches utilisées pour tester la migration cellulaire, le test basé sur la fermeture des plaies cellulaires est une méthode simple fréquemment utilisée dans les domaines de la physiologie et de l’oncologie10. Cette approche est utile en raison de sa pertinence pour le phénotype in vivo et est efficace pour déterminer les rôles des médicaments et des chimioattractants au cours de la migration cellulaire11. Il est possible d’évaluer la capacité de migration des masses cellulaires entières et des cellules individuelles en mesurant les distances d’écart cellulaire au fil du temps11. Dans ce manuscrit, un essai modifié in vitro basé sur la fermeture des plaies est introduit pour modéliser la migration NCC dans les tissus riches en HA entourant le tube neural. Cette procédure est également applicable à l’étude de différents composants de la MCE (collagène, fibronectine et laminine) afin d’analyser le rôle de l’échafaudage de la MCE dans la migration des CCN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diverses composantes de l’ECM régissent l’émigration et la migration des CCN. Par exemple, HA réglemente positivement la migration NCC 2,15. Fait intéressant, une étude basée sur des modèles génétiques murins de Tmem2, une hyaluronidase de surface cellulaire, a élucidé la nécessité de la dégradation de l’HA dans la migration NCC9. Les collagènes sont également abondants dans l’ECM entourant le tube neural<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J’exprime ma grande gratitude à Fumitoshi Irie et Yu Yamaguchi pour leurs encouragements et leurs aimables suggestions dans l’établissement de cette méthode. Ce travail a été soutenu par des subventions pour des programmes de recherche scientifique de la Société japonaise pour la promotion de la science (#19KK0232 à T.I., #20H03896 à T.I.). La méthode originale pour le revêtement de l’AH sur des substrats de verre et les essais de dégradation in situ de l’AH sur les substrats ont été décrits dans Yamamoto et coll. (2017)8, tandis que la méthode de préparation de substrats mixtes HA/Col1 a été décrite dans Irie et coll. (2021)7.
Materials
| 10cm cell culture dish | CORNING | Cat. 353003 | |
| 1X PBS | Millipore | Cat. No. BSS-1005-B | |
| 2-well culture inserts | ibidi | Cat. No. 80209 | |
| Alexa 555-labelled goat anti-mouse IgG | Invitrogen | Cat. A21422 | Goat derived anti-mouse secondary antibody |
| automated cell counter | Bio-Rad | Cat. No. TC20 | |
| CELLBANKER | ZENOGEN PHARMA | Cat. 11910 | Cell freezing medium |
| collagen type I | Sigma | Cat. No. 08-115 | |
| Complete ES Cell Medium | Millipore | Cat. No. ES-101-B | |
| DAPI | Invitrogen | Cat. 10184322 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | Cat. 11971025 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | Cat. 10270106 | |
| fluorescence microscope | Keyence | Cat. No. BZ-X700 | |
| Fluoresent labelled HA | PG Research | FAHA-H2 | |
| Glas bottom dish | Iwaki | Cat. 11-0602 | |
| glutaldehyde | Sigma | Cat. No. G5882 | |
| Matrigel | Fisher | Cat. No. CB-40234 | The basement-membrane matrix |
| monoclonal anti-vinculin antibody | Sigma | Cat. No. V9264 | |
| mounting media | Dako | S3023 | |
| Normal goat serum | Fisher | Cat. 50062Z | |
| O9-1 cells | Millipore | Cat. No. SCC049 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | Cat. 158127 | |
| triethoxysilane | Sigma | Cat. No. 390143 | |
| trypsin-EDTA | Millipore | Cat. No. SM-2003-C |
References
- Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326 (2013).
- Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
- Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
- Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
- Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
- Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
- Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481 (2021).
- Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
- Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765 (2022).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
- Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
- Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
- Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
- Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
- Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
- Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).
- Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927 (2016).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
- Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
- Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
- Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
- Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).
