Этот протокол описывает генерацию самоорганизующихся кровеносных сосудов из плюрипотентных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Эти сети кровеносных сосудов демонстрируют обширную и связанную эндотелиальную сеть, окруженную перицитами, актином гладких мышц и непрерывной базальной мембраной.
Органоид определяется как сконструированная многоклеточная ткань in vitro , которая имитирует соответствующий орган in vivo , так что ее можно использовать для изучения определенных аспектов этого органа в чашке для культивирования тканей. Широта и применение исследований органоидов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC), значительно продвинулись вперед и включают мозг, сетчатку, слезный проток, сердце, легкие, кишечник, поджелудочную железу, почки и кровеносные сосуды, а также ряд других тканей. В частности, разработка методов генерации микрососудов человека открыла путь для моделирования развития кровеносных сосудов человека и заболеваний in vitro , а также для тестирования и анализа новых лекарств или тканевого тропизма при вирусных инфекциях, включая SARS-CoV-2. Сложные и длинные протоколы, лишенные визуального руководства, препятствуют воспроизводимости многих органоидов, полученных из стволовых клеток. Кроме того, неотъемлемая стохастичность процессов формирования органоидов и самоорганизации требует создания оптических протоколов для углубления понимания приобретения и программирования клеточной судьбы. Здесь представлен визуально управляемый протокол для генерации 3D-органоидов кровеносных сосудов человека (BVO), разработанных из hPSC. Представляя непрерывную базальную мембрану, эндотелиальные клетки сосудов и организованное сочленение с клетками фрески, BVO демонстрируют функциональные, морфологические и молекулярные особенности микроциркуляторного русла человека. Образование BVO инициируется путем образования агрегатов, за которым следует мезодерма и сосудистая индукция. Созревание сосудов и формирование сети инициируются и поддерживаются путем встраивания агрегатов в 3D-коллагеновую и солюбилизированную матрицу базальной мембраны. Сети сосудов человека формируются в течение 2-3 недель и могут быть дополнительно выращены в масштабируемых системах культивирования. Важно отметить, что BVO, трансплантированные мышам с ослабленным иммунитетом, анастомозируют эндогенное кровообращение мыши и попадают в функциональные артерии, вены и артериолы. Настоящий визуально управляемый протокол будет способствовать исследованиям органоидов человека, особенно в отношении кровеносных сосудов в нормальном развитии, васкуляризации тканей и заболеваний.
Сосудистая дисфункция и заболевания кровеносных сосудов проявляются выраженными осложнениями в функциях органов. Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смерти во всеммире1, а также основным фактором, способствующим увеличению расходов на здравоохранение в Соединенных Штатах. Число случаев сердечно-сосудистых заболеваний ежегодно увеличивается, и рост числа этих случаев происходит в более молодых возрастных группах (20-45 лет)2. Было разработано несколько моделей in vivo для изучения развития и созревания кровеносных сосудов, сосудистых заболеваний и эндотелиальной дисфункции 3,4. В настоящее время методы, объединяющие одиночные и множественные клетки, определенные по происхождению, полученные из стволовых клеток или выделенные из тканей взрослого человека in vivo, могут создавать сосудистые сети, которые воспроизводят аспекты сосудистой функции и анатомии человека 5,6. Кровеносные сосуды возникли как одна из первых функциональных систем во время развития мезодермы, и они организуются либо посредством процесса сборки, называемого «васкулогенезом», либо путем расширения и разветвления от ранее существовавших сосудов, что называется «ангиогенезом»7.
Используя возможности биологии развития и самоуправляемой сборки, Wimmer et al. сообщили о первых самоорганизующихся 3D-органоидах кровеносных сосудов человека из hPSC, которые демонстрируют функциональные, морфологические и молекулярные характеристики микроциркуляторного русла человека8. Подобно сосудистой сетичеловека 9, эти hBVO генерируются и присутствуют эндотелием, непрерывной базальной мембраной и окружающими клетками 8,10. hBVO могут быть трансплантированы in vivo и анастомозированы эндогенным кровообращением. Они также могут подвергаться созреванию in vitro и служить моделями сердечно-сосудистых заболеваний (например, диабета)8 или тканевого тропизма при вирусных инфекциях, таких как SARS-CoV-211. Несмотря на то, что ранее мы опубликовали письменный протокол10, не существует доступного видеопротокола для этого сложного метода.
Благодаря краткой ступенчатой прогрессии образование hBVO осуществляется путем формирования агрегатов, индукции мезодермы с использованием агониста WNT, Chiron (CHIR99021) и костного морфогенного белка – 4 (BMP4)12,13, сосудистой индукции с помощью фактора роста эндотелия сосудов A (VEGFA) и Forskolin (Fors)12 и встраивания в пользовательскую матрицупрорастания 8,10. Созревание сосудов и образование сетки следуют за встраиванием агрегатов в прорастающую матрицу. Эти сети сосудов человека формируются в течение 2-3 недель и могут быть удалены из матрицы прорастания и далее выращиваться в масштабируемых системах культивирования до 6 месяцев. Здесь проводятся процедуры под оптическим контролем для формирования и применения сосудистой сети, полученной из стволовых клеток человека.
Недавние прорывы в органоидных культурах, полученных из стволовых клеток, обеспечили основу для более продвинутых и физиологически значимых моделей сосудистой сети человека. Представленная здесь модель органоида кровеносных сосудов человека (hBVO), разработанная в нашей лаборатории 8,10, предоставляет мощные средства для изучения не только дальнейших аспектов васкулогенеза человека, но и новых путей моделирования заболеваний и регенеративной терапии 8,10,11. Несколько моделей in vivo были использованы для изучения развития и созревания кровеносных сосудов, сосудистых заболеваний и эндотелиальной дисфункции 3,4. Различные подходы объединяют одиночные и множественные клетки, определенные по происхождению, либо полученные из стволовых клеток, либо выделенные из взрослых тканей in vivo, для создания репликативных сосудистых сетей человека 5,6. Представленный здесь протокол использует принцип биологии развития и самоорганизации, чтобы получить первые в истории сети кровеносных сосудов человека с несколькими клетками, которые могут быть созданы, по сути, из одного hPSC 8,10.
Каждая линия стволовых клеток имеет уникальный генетический состав и отличается от других с точки зрения источника, функции и чувствительности15. Таким образом, протокол для органоидов кровеносных сосудов человека (hBVO) был разработан и оптимизирован для обеспечения надежной и воспроизводимой совместимости протокола с несколькими (>12) различными линиями hPSC 8,10. Описанный здесь метод генерирует органоиды кровеносных сосудов, полученные из hPSC, в течение 2 недель. Однако изменения в составе среды и/или методах генерации hBVO могут привести к неэффективной сети сосудов и генерации органоидов. Различные скорости пролиферации отдельных линий стволовых клеток также заметно влияют на воспроизводимость экспериментов со стволовыми клетками15 и, следовательно, органоидных культур. Например, при генерации BVO большее количество пролиферативных клеток или большее количество крупных агрегатов 1-го дня по своей природе подвержены различным метаболическим средам и параметрам диффузии газов и питательных веществ. Это, в свою очередь, изменяет время и эффективность воздействия фактора роста, степень дифференцировки и прайминга сосудов и, самое главное, способность образовывать сосудистые сети при встраивании агрегатов в коллаген 1 и солюбилизированный матрикс базальной мембраны.
Пассивная диффузия кислорода и введение необходимых питательных веществ из внешней среды не идеальны для долгосрочного роста клеток 3D-органоидов и морфогенеза тканей in vitro16. Несмотря на то, что это зависит от нескольких факторов (т.е. скорости метаболизма в тканях, биодоступности питательных веществ и газов, статической или динамической среды), для тканей, культивируемых in vitro, был установлен общий предел диффузии 150 мкм O2 и питательных веществ, учитывая, что физиологически ткани человека представляют собой связки живых клеток в пределах 150 мкм от перфузированных кровеносных сосудов17. Хотя также были предложены эффективные расстояния диффузии газа и питательных веществ 70-200 мкм18,19,20,21, плотность конструкции, температура, рН и состав среды значительно влияют на эффективность диффузии. Благодаря оптимизации площади поверхности и коммуникации интегрин-бета-рецептора после встраивания на 6-й день агрегаты диаметром 250-300 мкм работают лучше, чем агрегаты диаметром >500-600 мкм, что приводит к полному процессу прорастания сосуда и минимально конденсированному органоидному ядру. Таким образом, размер агрегата имеет решающее значение и может зависеть как от количества ячеек, используемых во время первоначального посева, так и от времени, отведенного на формирование агрегата. Пластины с микролунками, которые позволяют контролировать размер заполнителя и номер22, являются жизнеспособной альтернативой методу формирования стохастических заполнителей, полученному в результате использования 6-луночных планшетов со сверхнизким креплением в этом протоколе. Последовательность в сроках и управлении размерами агрегатов в течение первых 6 дней протокола hBVO является одним из, если не самым важным, показателем успешного развития добросовестных органоидов кровеносных сосудов.
Изменения среды на 1-й день (индукция мезодермы) и на 4-й день (сосудистая индукция) должны быть завершены в сочетании с оседанием агрегатов. Хотя центрифугирование является заманчивой альтернативой, дополнительные силы, приложенные к слабо собранным агрегатам, могут вызвать нежелательное слипание, сборку и сдвиг, что отрицательно влияет на дифференциацию, созревание и эффективность прорастания на более поздних стадиях протокола. Работа на льду в течение 6-го дня процесса встраивания имеет решающее значение для сохранения правильной полимеризации ECM и формирования слоя. Во время индукции заделки и прорастания заполнителя воздействие на ЭБМ температур выше 4°С и/или рН ЭБМ, отличный от 7,4, повлияет не только на скорость полимеризации и целостность слоя ЭКМ, но и на эффективность прорастания встроенных заполнителей. Эластичная природа матрицы для проращивания ECM позволяет легко отсоединять и транспортировать из 12-луночной чашки для культивирования на стерильную режущую поверхность. Отдельные органоиды, удаленные из матрицы и перенесенные на 96-луночные пластины со сверхнизким прикреплением, будут потреблять оставшуюся окружающую ECM и сохранять самоорганизующиеся сети эндотелиальных микрососудов, покрытые клетками, с непрерывной базальной мембраной.
Хотя это предложение не охвачено этим предложением, изменения в составах сред могут воспроизводить заболевания, которые, в свою очередь, провоцируют патологические реакции в hBVOs 8,11. Границы моделирования заболеваний с использованием системы hBVO далеко не известны, и это, безусловно, область, которая нуждается в исследовании. Применение нашей технологии органоидов кровеносных сосудов в васкуляризации ранее аваскулярных органоидных конструкций23 также имеет значительное влияние и интерес.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим всех сотрудников наших лабораторий за критический вклад и обсуждения. JMP получила финансирование от Фонда Т. фон Застрова, премию FWF Витгенштейна (Z 271-B19), Австрийскую академию наук, совместное предприятие Innovative Medicines Initiative 2 (JU) в рамках грантового соглашения No 101005026, Leducq Transatlantic Networks of Excellence in Cardiovascular Research, Программу выдающихся исследователей Института Аллена и Канадскую программу 150 исследовательских кафедр F18-01336, а также гранты Канадских институтов исследований в области здравоохранения COVID-19 F20-02343 и F20-02015.
1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
2-Mercaptoethanol | Millipore | 60-24-2 | |
7.5% sodium bicarbonate | Gibco | 5080094 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | cell dissociation reagent |
Albumin fraction V (BSA) | AppliChem | A1391, 0100 | |
Alexa Fluor 488–anti-rabbit IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 711-546-152 |
Alexa Fluor 488–anti-sheep IgG | — | Life Technologies | A11015 |
Alexa Fluor 647–anti-goat IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 705-606-147 |
Automated cell counter | Invitrogen | Countess II | |
B27 supplement | Gibco | 12587010 | |
Biological safety cabinet | Faster | SafeFAST Premium 212 | |
BMP4 | Miltenyi BioTec | 130-111-165 | |
CD31 | Endothelial cell | DAKO | M0823 |
CD31 | Endothelial cell | R&D | AF806 |
Cellulose wipes | |||
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 4 KR | |
CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure) | |||
CO2 incubator | New Brunswick | Galaxy 170S | |
Collagen type IV | Basement membrane | Millipore | AB769 |
Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives) | Leica | SP8 | |
Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue | Invitrogen | C10283 | |
Coverslips (22 x 50 mm) | |||
Cy3–anti-mouse IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 715-166-150 |
DAPI | Sigma | D9542 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
Dulbecco's Modefied Eagle's Medium (DMEM) | Sigma | D5648-10L | |
Eppendorf tubes | |||
Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Fetal Bovien Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
FGF2 | Miltenyi BioTec | 130-093-841 | |
Fine forceps | FST | 11254-20 | |
Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides | Fisher Scientific | 12-550-016 | |
Forskolin | Sigma | F3917 | |
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Fisher Scientific | A1413302 | |
Glutamax | Gibco | 35050061 | |
Ham's F12 | Gibco | 11765054 | |
Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC | Thermo Scientific | Heraguard | |
Inverted contrasting tissue culture microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
iSpacer | SunJinLab | IS009 | |
KnockOut DMEM/F12 | Gibco | 12660012 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
non-essential amino acids (NEAAs) | Gibco | 11140035 | |
Orbital shaker | |||
Parafilm | |||
Paraformaldehyde (4%) in PBS | Boston BioProducts | BM-155 | |
PDGFR-β | Pericyte | R&D | AF385 |
PDGFR-β | Pericyte | Cell Signaling | 3169S |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
pH indicator strips (6.5-10) | Mquant, Millipore | 109543 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Pipettes (P1000, P200 and P20) | Gilson, Integra Pipetboy | ||
Prime Surface-U 96-well plates | Sumilon | MS9096-U | |
PurCol | Advanced BioMatrix | 5005 | |
RapiClear CS gel | SunJinLab | RCCS005 | |
RapiClear CS mounting solution | SunJinLab | RCCS002 | |
Serological pipettes (5, 10 and 25 mL) | Falcon | 357529, 357530, 357515 | |
SMA | vSMC/Pericyte | Sigma | 2547 |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N) | Sigma | S2770 | |
Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel) | Corning | 356231 | |
Stainless steel micro spatula (rounded end) | Fisher Scientific | 21-401-5 | |
Stainless steel spoon (double-ended) | Fisher Scientific | BelArt H367290018 | |
Stemflex medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell culture medium |
StemPro-34 SFM | Gibco | 10639011 | flexible serum-free medium |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 μL) | Biozym, Surphob | VT0270, VT0250, VT0220 | |
Tissue culture–treated 12-well plates TC | BD Falcon | 353043 | |
Tissue culture–treated 6-well plates | Eppendorf | 30720113 | |
Triton X-100 | Sigma | 93420 | |
Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red | Thermo Scientific | 12605010 | mammalian cell dissociating enzyme |
Tween 20 | Sigma | P7949 | |
Ultra-low-attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
Water bath (37 °C) | Fisher Scientific | Isotemp 210 | |
Y-27632 | Calbiochem | 688000 |