Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von selbstorganisierenden Blutgefäßen aus humanen pluripotenten und induzierten pluripotenten Stammzellen. Diese Blutgefäßnetzwerke weisen ein ausgedehntes und verbundenes Endothelnetzwerk auf, das von Perizyten, Aktin der glatten Muskulatur und einer durchgehenden Basalmembran umgeben ist.
Ein Organoid ist definiert als ein künstlich hergestelltes multizelluläres In-vitro-Gewebe , das sein entsprechendes In-vivo-Organ nachahmt, so dass es verwendet werden kann, um definierte Aspekte dieses Organs in einer Gewebekulturschale zu untersuchen. Die Breite und Anwendung der Forschung an humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) hat sich erheblich weiterentwickelt und umfasst unter anderem das Gehirn, die Netzhaut, den Tränenkanal, das Herz, die Lunge, den Darm, die Bauchspeicheldrüse, die Niere und die Blutgefäße. Die Entwicklung von Methoden zur Erzeugung menschlicher Mikrogefäße hat insbesondere den Weg für die Modellierung der Entwicklung und Erkrankung menschlicher Blutgefäße in vitro sowie für die Erprobung und Analyse neuer Medikamente oder Gewebetropismus bei Virusinfektionen, einschließlich SARS-CoV-2, geebnet. Komplexe und langwierige Protokolle, denen es an visueller Anleitung mangelt, behindern die Reproduzierbarkeit vieler aus Stammzellen gewonnener Organoide. Darüber hinaus erfordert die inhärente Stochastizität von Organoidbildungsprozessen und Selbstorganisation die Generierung optischer Protokolle, um das Verständnis der Erfassung und Programmierung des Zellschicksals zu verbessern. In dieser Arbeit wird ein visuell geführtes Protokoll für die Erzeugung von 3D-Organoiden (BVOs) aus hPSCs vorgestellt. Mit einer durchgehenden Basalmembran, vaskulären Endothelzellen und einer organisierten Artikulation mit Wandzellen weisen BVOs die funktionellen, morphologischen und molekularen Merkmale des menschlichen Mikrogefäßsystems auf. Die BVO-Bildung wird durch Aggregatbildung eingeleitet, gefolgt von Mesoderm- und vaskulärer Induktion. Die vaskuläre Reifung und Netzwerkbildung wird durch die Einbettung von Aggregaten in eine 3D-Kollagen- und solubilisierte Basalmembranmatrix initiiert und unterstützt. Menschliche Gefäßnetzwerke bilden sich innerhalb von 2-3 Wochen und können in skalierbaren Kultursystemen weiter gezüchtet werden. Wichtig ist, dass BVOs, die in immungeschwächte Mäuse transplantiert werden, mit der endogenen Mauszirkulation anastomosieren und in funktionelle Arterien, Venen und Arteriolen spezifizieren. Das vorliegende visuell gesteuerte Protokoll wird die Forschung an menschlichen Organoiden voranbringen, insbesondere in Bezug auf Blutgefäße in normaler Entwicklung, Gewebevaskularisierung und Krankheiten.
Gefäßfunktionsstörungen und Erkrankungen der Blutgefäße führen zu deutlichen Komplikationen der Organfunktionen. Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache1 und tragen auch am häufigsten zum Anstieg der Gesundheitskosten in den Vereinigten Staaten bei. Die Fallzahlen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen steigen von Jahr zu Jahr, und die Zahl dieser Fälle steigt in jüngeren Altersgruppen (20-45 Jahre)2. Es wurden mehrere In-vivo-Modelle entwickelt, um die Entwicklung und Reifung von Blutgefäßen, Gefäßerkrankungen und endotheliale Dysfunktionen zu untersuchen 3,4. Derzeit können Methoden, die einzelne und mehrere liniendefinierte Zellen kombinieren, die entweder aus Stammzellen gewonnen oder in vivo aus adultem Gewebe isoliert wurden, vaskuläre Netzwerke schaffen, die Aspekte der menschlichen Gefäßfunktion und -anatomie nachbilden 5,6. Blutgefäße haben sich während der Entwicklung aus dem Mesoderm als eines der ersten funktionellen Systeme herausgebildet und organisieren sich entweder durch einen Prozess der Assemblierung, der als “Vaskulogenese” bezeichnet wird, oder durch Erweiterung und Verzweigung von bereits vorhandenen Gefäßen, was als “Angiogenese” bezeichnet wird7.
Wimmer et al. nutzten die Möglichkeiten der Entwicklungsbiologie und der selbstgesteuerten Assemblierung und berichteten über die ersten selbstorganisierenden 3D-Organoide menschlicher Blutgefäße aus hPSCs, die die funktionellen, morphologischen und molekularen Eigenschaften des menschlichen Mikrogefäßsystems aufweisen8. Ähnlich wie das menschliche Gefäßsystem9 werden diese hBVOs mit einem Endothel, einer durchgehenden Basalmembran und umgebenden Wandzellen gebildet und liegen vor 8,10. Die hBVOs können in vivo transplantiert und mit dem endogenen Kreislauf anastomosiert werden. Sie können auch in vitro reifen und als Modelle für Herz-Kreislauf-Erkrankungen (z. B. Diabetes)8 oder Gewebetropismus bei Virusinfektionen wie SARS-CoV-2dienen 11. Obwohl wir zuvor ein schriftliches Protokoll10 veröffentlicht haben, gibt es kein verfügbares Videoprotokoll für diese ansonsten komplexe Technik.
Durch eine prägnante schrittweise Progression wird die hBVO-Bildung durch Aggregatbildung, Mesoderm-Induktion mit einem WNT-Agonisten, Chiron (CHIR99021) und knochenmorphogenem Protein – 4 (BMP4)12,13, vaskuläre Induktion über vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor A (VEGFA) und Forskolin (Fors)12 und Einbettung in eine benutzerdefinierte Sprossungsmatrixerreicht 8,10. Die Gefäßreifung und Netzwerkbildung erfolgt nach der Einbettung der Aggregate in die Keimmatrix. Diese menschlichen Gefäßnetzwerke bilden sich innerhalb von 2-3 Wochen und können aus der Keimmatrix entfernt und in skalierbaren Kultursystemen bis zu 6 Monate weiter gezüchtet werden. Hier werden optisch gesteuerte Verfahren zur Bildung und Applikation von humanen Stammzellgefäßen bereitgestellt.
Jüngste Durchbrüche bei Stammzell-abgeleiteten Organoidkulturen haben den Rahmen für fortschrittlichere und physiologisch relevante Modelle des menschlichen Gefäßsystems geschaffen. Das hier vorgestellte Modell des humanen Blutgefäßorganoids (hBVO), das inunserem Labor 8,10 entwickelt wurde, bietet ein leistungsfähiges Mittel, um nicht nur weitere Aspekte der menschlichen Vaskulogenese, sondern auch neue Wege der Krankheitsmodellierung und regenerativen Therapie zu erforschen 8,10,11. Mehrere In-vivo-Modelle wurden verwendet, um die Entwicklung und Reifung von Blutgefäßen, Gefäßerkrankungen und endotheliale Dysfunktionen zu untersuchen 3,4. Unterschiedliche Ansätze kombinieren einzelne und mehrere liniendefinierte Zellen, die entweder aus Stammzellen gewonnen oder in vivo aus adultem Gewebe isoliert wurden, um replikative menschliche Gefäßnetzwerke zu schaffen 5,6. Das hier vorgestellte Protokoll nutzt das Prinzip der Entwicklungsbiologie und Selbstorganisation, um die ersten menschlichen Blutgefäßnetzwerke mit mehreren Zellen zu erzeugen, die im Wesentlichen aus einem einzigen hPSC 8,10 generiert werden können.
Jede Stammzelllinie hat eine einzigartige genetische Ausstattung und unterscheidet sich von anderen in Bezug auf ihre Beschaffung, Funktion und Reaktionsfähigkeit15. Daher wurde das Protokoll für humane Blutgefäß-Organoide (hBVOs) entwickelt und optimiert, um eine robuste und reproduzierbare Protokollkompatibilität mit mehreren (>12) verschiedenen hPSC-Linienzu gewährleisten 8,10. Die hier beschriebene Methode erzeugt über einen Zeitraum von 2 Wochen hPSC-abgeleitete Blutgefäßorganoide. Änderungen der Medienzusammensetzung und/oder der Techniken bei der hBVO-Erzeugung können jedoch zu einer ineffektiven Gefäßvernetzung und Organoiderzeugung führen. Die unterschiedlichen Proliferationsraten einzelner Stammzelllinien wirken sich auch deutlich auf die Reproduzierbarkeit von Stammzellexperimenten15 und damit von Organoidkulturen aus. Zum Beispiel unterliegen bei der Erzeugung der BVOs proliferativere Zellen oder eine höhere Anzahl großer Tag-1-Aggregate von Natur aus unterschiedlichen Stoffwechselumgebungen und Gas- und Nährstoffdiffusionsparametern. Dies wiederum verändert die Expositionszeiten und -effizienzen des Wachstumsfaktors, den Grad der Differenzierung und des vaskulären Primings und vor allem die Fähigkeit, Gefäßnetzwerke zu bilden, wenn die Aggregate in die Kollagen-1- und solubilisierte Basalmembranmatrix eingebettet werden.
Die passive Diffusion von Sauerstoff und die Verabreichung essentieller Nährstoffe aus der äußeren Umgebung ist nicht ideal für das langfristige Zellwachstum von 3D-Organoiden und die Gewebemorphogenese in vitro16. Obwohl dies von mehreren Faktoren abhängt (z. B. der Stoffwechselrate des Gewebes, der Bioverfügbarkeit von Nährstoffen und Gasen, einer statischen oder dynamischen Umgebung), wurde für in vitro kultivierte Gewebe ein allgemeiner Grenzwert von 150 μmO2 und Nährstoffdiffusion festgelegt, da menschliche Gewebe physiologisch gesehen Stränge lebender Zellen innerhalb von 150 μm von perfundierten Blutgefäßen aufweisen17. Obwohl auch effektive Gas- und Nährstoffdiffusionsabstände von 70-200 μm vorgeschlagen wurden18,19,20,21, haben die Konstruktdichte, die Temperatur, der pH-Wert und die Medienzusammensetzung einen signifikanten Einfluss auf die Diffusionseffizienz. Aufgrund der Oberflächenoptimierung und der Integrin-beta-Rezeptor-Kommunikation nach der Einbettung am Tag 6 schneiden Aggregate mit einem Durchmesser von 250-300 μm besser ab als solche mit einem Durchmesser von >500-600 μm, was zu einem vollständigen Gefäßkeimungsprozess und einem minimal kondensierten Organoidkern führt. Daher ist die Aggregatgröße entscheidend und kann sowohl von der Anzahl der Zellen, die während der ersten Aussaat verwendet werden, als auch von der für die Aggregatbildung vorgesehenen Zeit beeinflusst werden. Mikrotiterplatten, die eine Kontrolle über die Aggregatgröße und die Anzahl22 ermöglichen, sind eine praktikable Alternative zu der ansonsten stochastischen Aggregatbildungstechnik, die sich aus der Verwendung von 6-Well-Platten mit extrem niedriger Bindung in diesem Protokoll ergibt. Die Konsistenz des Timings und des Managements der Aggregatgrößen während der ersten 6 Tage des hBVO-Protokolls ist einer der, wenn nicht sogar der wichtigste Indikator für die erfolgreiche Entwicklung von echten Blutgefäßorganoiden.
Mediumwechsel an Tag 1 (Mesoderm-Induktion) und Tag 4 (vaskuläre Induktion) müssen in Kombination mit der Sedimentation der Aggregate abgeschlossen werden. Obwohl die Zentrifugation eine verlockende Alternative ist, können die zusätzlichen Kräfte, die auf die schwach zusammengesetzten Aggerate ausgeübt werden, zu unerwünschter Verklumpung, Assemblierung und Scherung führen, was sich negativ auf die Differenzierung, Reifung und Keimungseffizienz in den späteren Phasen des Protokolls auswirkt. Die Arbeit auf Eis während des Einbettprozesses von Tag 6 ist entscheidend für die Aufrechterhaltung einer ordnungsgemäßen ECM-Polymerisation und Schichtbildung. Während der Einbettung und Induktion von Aggregaten wirkt sich die Exposition des ECM bei Temperaturen über 4 °C und/oder einem anderen ECM-pH-Wert als 7,4 nicht nur auf die Polymerisationsraten und die Integrität der ECM-Schicht, sondern auch auf die Keimeffizienz der eingebetteten Aggregate aus. Die elastische Beschaffenheit der ECM-Sprossenmatrix ermöglicht ein einfaches Abnehmen und Transportieren von der 12-Well-Kulturschale zur sterilen Schneidefläche. Einzelne Organoide, die aus der Matrix entfernt und auf 96-Well-Platten mit extrem niedriger Anhaftung übertragen werden, verbrauchen die verbleibende umgebende EZM und behalten selbstorganisierte, mit Wandzellen beschichtete endotheliale Mikrogefäßnetzwerke mit einer durchgehenden Basalmembran bei.
Obwohl sie in diesem Vorschlag nicht behandelt werden, können Veränderungen in der Medienzusammensetzung Krankheiten replizieren, die wiederum pathologische Reaktionen in hBVOs hervorrufen 8,11. Die Grenzen der Krankheitsmodellierung mit dem hBVO-System sind alles andere als bekannt, und dies ist sicherlich ein Bereich, der erforscht werden muss. Die Anwendung unserer Blutgefäß-Organoid-Technologie bei der Vaskularisierung von zuvor avaskulären Organoidkonstrukten23 ist ebenfalls von erheblicher Bedeutung und Interesse.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken allen Mitgliedern unserer Labore für kritische Anregungen und Diskussionen. JMP wurde von der T. von Zastrow-Stiftung, dem Wittgenstein-Preis des FWF (Z 271-B19), der Österreichischen Akademie der Wissenschaften, dem Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking (JU) im Rahmen der Fördervereinbarung Nr. 101005026, Leducq Transatlantic Networks of Excellence in Cardiovascular Research, dem Allen Institute Distinguished Investigator Program und dem Canada 150 Research Chairs Program F18-01336 sowie den Canadian Institutes of Health Research COVID-19 Grants F20-02343 und F20-02015 gefördert.
1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
2-Mercaptoethanol | Millipore | 60-24-2 | |
7.5% sodium bicarbonate | Gibco | 5080094 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | cell dissociation reagent |
Albumin fraction V (BSA) | AppliChem | A1391, 0100 | |
Alexa Fluor 488–anti-rabbit IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 711-546-152 |
Alexa Fluor 488–anti-sheep IgG | — | Life Technologies | A11015 |
Alexa Fluor 647–anti-goat IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 705-606-147 |
Automated cell counter | Invitrogen | Countess II | |
B27 supplement | Gibco | 12587010 | |
Biological safety cabinet | Faster | SafeFAST Premium 212 | |
BMP4 | Miltenyi BioTec | 130-111-165 | |
CD31 | Endothelial cell | DAKO | M0823 |
CD31 | Endothelial cell | R&D | AF806 |
Cellulose wipes | |||
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 4 KR | |
CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure) | |||
CO2 incubator | New Brunswick | Galaxy 170S | |
Collagen type IV | Basement membrane | Millipore | AB769 |
Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives) | Leica | SP8 | |
Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue | Invitrogen | C10283 | |
Coverslips (22 x 50 mm) | |||
Cy3–anti-mouse IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 715-166-150 |
DAPI | Sigma | D9542 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
Dulbecco's Modefied Eagle's Medium (DMEM) | Sigma | D5648-10L | |
Eppendorf tubes | |||
Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Fetal Bovien Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
FGF2 | Miltenyi BioTec | 130-093-841 | |
Fine forceps | FST | 11254-20 | |
Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides | Fisher Scientific | 12-550-016 | |
Forskolin | Sigma | F3917 | |
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Fisher Scientific | A1413302 | |
Glutamax | Gibco | 35050061 | |
Ham's F12 | Gibco | 11765054 | |
Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC | Thermo Scientific | Heraguard | |
Inverted contrasting tissue culture microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
iSpacer | SunJinLab | IS009 | |
KnockOut DMEM/F12 | Gibco | 12660012 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
non-essential amino acids (NEAAs) | Gibco | 11140035 | |
Orbital shaker | |||
Parafilm | |||
Paraformaldehyde (4%) in PBS | Boston BioProducts | BM-155 | |
PDGFR-β | Pericyte | R&D | AF385 |
PDGFR-β | Pericyte | Cell Signaling | 3169S |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
pH indicator strips (6.5-10) | Mquant, Millipore | 109543 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Pipettes (P1000, P200 and P20) | Gilson, Integra Pipetboy | ||
Prime Surface-U 96-well plates | Sumilon | MS9096-U | |
PurCol | Advanced BioMatrix | 5005 | |
RapiClear CS gel | SunJinLab | RCCS005 | |
RapiClear CS mounting solution | SunJinLab | RCCS002 | |
Serological pipettes (5, 10 and 25 mL) | Falcon | 357529, 357530, 357515 | |
SMA | vSMC/Pericyte | Sigma | 2547 |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N) | Sigma | S2770 | |
Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel) | Corning | 356231 | |
Stainless steel micro spatula (rounded end) | Fisher Scientific | 21-401-5 | |
Stainless steel spoon (double-ended) | Fisher Scientific | BelArt H367290018 | |
Stemflex medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell culture medium |
StemPro-34 SFM | Gibco | 10639011 | flexible serum-free medium |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 μL) | Biozym, Surphob | VT0270, VT0250, VT0220 | |
Tissue culture–treated 12-well plates TC | BD Falcon | 353043 | |
Tissue culture–treated 6-well plates | Eppendorf | 30720113 | |
Triton X-100 | Sigma | 93420 | |
Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red | Thermo Scientific | 12605010 | mammalian cell dissociating enzyme |
Tween 20 | Sigma | P7949 | |
Ultra-low-attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
Water bath (37 °C) | Fisher Scientific | Isotemp 210 | |
Y-27632 | Calbiochem | 688000 |