Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Kan Damarı Organoidlerinin Üretimi

Burada yapılan tüm deneylerde ticari olarak temin edilebilen H9 insan iPSC hattı kullanılmıştır. Ticari olarak yaygın ve ticari olarak temin edilemeyen insan pluripotent kök hücre hatları (yani, H9, NC8) de bu protokolü kullanarak insan kan damarı organoidlerinin üretimi için test edilmiş ve etkili olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıntılar için lütfen daha önce yayınlanmış 8,10 numaralı raporlarımıza bakın. 1. İnsan kan damarı organoidlerinin üretimi için medya ve reaktif formülasyonu Toplama ortamını hazırlayın.40 mL nakavt DMEM/F12 (insan ESC ve iPSC büyümesi için optimize edilmiş L-glutamin veya HEPES tamponu içermeyen düşük ozmolalite ortamı), 10 mL nakavt serum replasmanı (KOSR), %0,85 NaCl içinde 0,5 mL 200 mM L-alanil-L-glutamin dipeptidi, 0,5 mL esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 35 μL beta-merkaptoetanol (BME, 10 mL steril PBS içinde 100 μL 2-merkaptoetanol), ve Y-27632 (1:200’de Rho ile ilişkili, sarmal bobin içeren protein kinaz [ROCK]14 [10 mM] hücre geçirgen ve seçici inhibitörü) (bkz. N2B27 (N2 ve B27 takviyeli temel ortam) hazırlayın.25 mL DMEM / F12, 25 mL nörobazal ortam, 1 mL B27 takviyesi, 0.5 mL N2 takviyesi, 250 μL 200 mM L-alanil-L-glutamin dipeptidi% 0.85 NaCl ve 35 μL beta-merkaptoetanol karıştırın (bkz. Mezoderm indüksiyon ortamını hazırlayın.ChiR (12 μM, mezoderm indüksiyonunu uyaran GSK3a / b inhibitörü) ve BMP-4 (30 ng / mL, mezoderm soyunu indükleyen MSX2 aktivatörü) ile N2B27 besiyeri takviyesi.NOT: Stok (ChiR): 10 mM (1:833 veya 1,2 μL/mL N2B27 kullanın). Stok (BMP-4): 100 μg/mL (1:3333 veya 0,3 μL/mL N2B27 kullanın) ( bkz. Vasküler indüksiyon ortamını hazırlayın.N2B27 ortamını VEGFA (100 ng / mL) ve forskolin (2 μM) ile tamamlayın ( bkz. Hücre dışı matrisi (ECM) hazırlayın.12 delikli bir plakanın bir kuyucuğu için 1 mL ECM kullanın (30-50 agrega gömmek için). Her bir kuyu için kullanılan 1 mL ECM çözeltisinden, bir alt katman oluşturmak için 0,5 mL, ECM temeli olarak hizmet edecek “katman 1” ve üst katman “katman 2” için 0,5 mL artı agregalar kullanın. Bu yaklaşımın kullanılması, ECM süspansiyonu aracılığıyla, insan kan damarı ağlarının her yönde filizlenmesi için yeterli alan ve destek sağlar.NOT: Genel olarak, 1 mL ECM, 500 μL saflaştırılmış sığır kollajen tip I, Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomu hücreleri tarafından salgılanan 250 μL çözünür bazal membran matrisi (bakınız Malzeme Tablosu) ve 250 μL bazik matris çözeltisi (adım 1.5.2) içerir. Taze hazırlayın ve kullanıma hazır olana kadar buzda tutun. Dört adet 12 kuyucuklu plaka (48 kuyucuk) için temel matris çözeltisini hazırlamak için, 5,627 mL 0,1 N NaOH, 2,498 mL 10x DMEM, 473 μL HEPES, 368 μL% 7,5 sodyum bikarbonat, 233 μL 200 mM L-alanil-L-glutamin dipeptidi% 0,85 NaCl ve 3,451 mL Ham’ın F-12’sini karıştırın (bkz.NOT: Artık bazik matris çözeltisi, kapaklı 50 mL yüksek netlikli polipropilen konik tüpe yerleştirilebilir ve 2 aya kadar kullanım için 4 ° C’de saklanabilir. Filizlenme ortamını hazırlayın.İnsan hematopoetik hücrelerinin gelişimini desteklemek için 50 mL esnek serumsuz ortam (SFM), esnek serumsuz orta besin takviyesinin 1.3 mL aliquot’u, % 15 fetal sığır serumu (FBS), 250 μL penisilin-streptomisin, 500 μL’si 200 mM L-alanil-L-glutamin dipeptidi% 0.85 NaCl, VEGFA (100 ng / mL) ve FGF2’de (100 ng / mL) spesifik olarak formüle edin (bkz. Engelleme arabelleğini hazırlayın.0,5 g sığır serum albümini, 1,5 mL fetal sığır serumu, 250 μL Tween 20, 250 μL Triton X-100, 500 μL sodyum deoksikolat (%1 ağırlık/hacim stoğu) ve 47,5 mL 1x fosfat tamponlu salin karıştırın (bkz. Tüm bileşenler iyi bir şekilde birleştirilene ve çözüm netleşene kadar pipeti yukarı ve aşağı çekin. 2. İnsan pluripotent ve indüklenmiş pluripotent kök hücrenin bakımı ve kültürü LDEV’siz indirgenmiş büyüme faktörü bazal membran matrisi (1:50 seyreltme) ile kaplanmış kök hücre kültürü ortamına sahip 6 kuyucuklu doku kültürü plakaları kullanarak hücre kültürü gerçekleştirin (bkz. Hücreler ~% 70 akıcılığa ulaştığında, 37 ° C’de 3-4 dakika boyunca 1 mL memeli hücresi ayrışma enzimi ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak onları geçirin.NOT: Hücrelerin 1: 6 oranında bölünmesi, hücre canlılığını arttırır ve çoğu insan kök hücre hattı için 2-4 gün içinde akıcılık sağlar. Hücre canlılığını arttırmak için, ROCK inhibitörü Y-27632 takviyeli (10 mM, 1: 1.000) kültür ortamı, geçiş sonrası 24 saat boyunca kullanılır. Kültür ortamını% 70’lik bir akıcılığa ulaşana kadar günlük olarak değiştirin.NOT: Bu çalışma için,% 70 akıcılıkta, 6 delikli bir hücre kültürü plakasının bir kuyusu yaklaşık 1 milyon H9 hPSC içerir. 3. Gün 0 – Tek hücreli bir süspansiyondan pluripotent agregaların üretilmesi NOT: 6 delikli bir kültür plakasının iki kuyucuğunda ‘lik bir akıntı, yaklaşık 175 hBVO verecektir. Bir pipet veya vakum sistemi kullanarak, kültür ortamını aspire edin, 1 mL hücre ayrışma reaktifi ile değiştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 37 ° C’de 5 dakika inkübe edin. Hücreler hücre ayrışma reaktifi altındayken, 6 kuyucuklu ultra düşük bir bağlantı kültürü plakasında istenen sayıda kuyucuk için gerektiği gibi 15 mL’lik bir konik tüpte gerekli miktarda toplama ortamını (adım 1.1) hazırlayın (bkz. 1 mL hücre ayrışma reaktifini aspire edin ve hücreleri 1 mL agregasyon ortamında askıya alın. Numuneleri saymadan önce nazik yukarı-aşağı pipetleme ile tek hücreli bir süspansiyon oluşturun.DİKKAT: hPSC’ler mekanik strese karşı oldukça hassastır ve agresif pipetlemeye tolerans gösteremez. Otomatik bir hücre sayma cihazı10 veya mikroskop altında standartlaştırılmış bir sistem kullanarak hücreleri sayın. Deneme için gereken hücre numarasını hesaplayın.NOT: Hücre hattına bağlı olarak, 200.000 hücre/kuyu ila 300.000 hücre/kuyu agrega oluşumu için ideal kabul edilir (yani, 4 kuyucuk = toplamda 800.000 ila 1.200.000 hücre). Hücre süspansiyonunun uygun hacmini, 15 mL’lik yüksek berraklıktaki polipropilen konik tüpteki toplama ortamına ekleyin. Homojen bir hücre dağılımı sağlamak için seyreltilmiş hücre süspansiyonunu nazikçe yukarı ve aşağı pipetinleyin. Pipet, seyreltilmiş hücre süspansiyonunun 3 mL’sini, 6 delikli ultra düşük bağlantı kültürü plakasının istenen her bir kuyucuğuna yerleştirin. Plakayı inkübatöre yerleştirin (37 ° C,% 5 CO2,% >90 nem) ve inkübatör kapılarını mümkün olduğunca açıp kapatmaktan kaçının.NOT: Bu ilk adım en iyi akşamları veya düşük inkübatör trafiğinde tamamlanır. Hafif titreşimler bile agregaların boyutunu ve şeklini etkileyebilir ve bu da sonuçları bozabilir. 4. Gün 1 – Agregaların mezoderm indüksiyonu Tohumlamadan 24 saat sonra, 2-10 hücreden oluşan küçük agregaların mikroskop altında görülebildiğinden emin olun. Agregaları toplayın ve ortamı mezoderm indüksiyon ortamına değiştirmeden önce yerleşmelerine izin verin (adım 1.3). 6 kuyucuklu ultra düşük bağlantı kültürü plakasının kuyucuğu başına bir adet 15 mL yüksek netlikte polipropilen konik tüp kurun. Agregaları her bir kuyucuğun merkezinde toplamak için dairesel bir hareket (yani yörüngesel çalkalayıcı gibi) kullanın, agregaları ve çevresindeki ortamı her bir kuyudan nazikçe toplamak için 1 mL’lik bir pipet kullanın, bunları karşılık gelen 15 mL yüksek netlikli polipropilen konik tüplerine yerleştirin ve agregaların oda sıcaklığında çökelmesine izin verin. Toplandıktan sonra, çoğu hücre hattının / agregasının bu aşamada tortulanması için gereken süre olan 1 saat için bir zamanlayıcı ayarlayın.NOT: Süre 1 saatten azsa, 15 mL konik tüpün dibine yerleşmemiş olabilecek agregalar kaybedilebilir. Saat geçtikten sonra, dikkatli bir şekilde, süpernatantı bir pipet veya yüksek hassasiyetli bir aspire pompası ile aspire edin. Agregaların 15 mL konik tüpün dibinde bozulmadan kaldığından emin olun. Her 15 mL’lik konik tüpün agregalarını 2 mL mezoderm indüksiyon ortamında tekrar askıya alın ve 6 kuyucuklu ultra düşük bağlantı kültürü plakasının kendi kuyucuklarına geri yerleştirin. Plakayı inkübatöre (37 ° C) geri yerleştirin ve 4. güne kadar bırakın.NOT: Agregalar birbirine yapışır ve büyürse, 1 mL’lik bir pipet kullanarak, agregaların boyut olarak benzer olmasını sağlamak için her bir agrega kuyucuğunu günde bir kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetin. 5. Gün 4 – Agregaların vasküler indüksiyonu ve astarlanması Agregaları toplayın ve ortamı vasküler indüksiyon ortamına değiştirmeden önce yerleşmelerine izin verin (adım 1.4). 6 kuyucuklu ultra düşük bağlantı kültürü plakasının kuyucuğu başına bir adet 15 mL konik tüp kurun. Agregaları her bir kuyucuğun merkezinde toplamak için dairesel bir hareket (yani yörüngesel çalkalayıcı gibi) kullanın, agregaları ve çevresindeki ortamı her bir kuyudan nazikçe toplamak için 1 mL’lik bir pipet kullanın ve bunları karşılık gelen 15 mL konik tüplerine yerleştirin. Toplandıktan sonra, agregaların çökelmesine izin vermek için 30 dakika boyunca bir zamanlayıcı ayarlayın.NOT: Bu aşamada çoğu hücre satırı için 30 dakikalık bir süre gereklidir. Süre 30 dakikadan azsa, 15 mL konik tüpün dibine yerleşmemiş olabilecek agregaları kaybetme riski vardır. 30 dakika sonra, dikkatle, süpernatantı bir pipet veya yüksek hassasiyetli bir aspire pompası ile aspire edin. Agregaların 15 mL konik tüpün dibinde bozulmadan kaldığından emin olun. Her 15 mL’lik konik tüpün agregalarını 2 mL’lik vasküler indüksiyon ortamında tekrar askıya alın ve 6 kuyucuklu ultra düşük ataşman kültürü plakasının kendi kuyucuklarına geri yerleştirin. Plakayı inkübatöre (37 ° C) geri yerleştirin ve 6. güne kadar bırakın.NOT: 1 mL’lik bir pipet kullanarak, agregaların boyut olarak benzer olmasını sağlamak ve birbirlerine yapışmalarını veya birbirlerine yapışmalarını önlemek için her bir agrega kuyucuğunu günde bir kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetin. 6. Gün 6 – Agrega gömme ve kap filiz indüksiyonu Buz üzerinde çalışırken, ECM çözeltisinin istenen son hacmini hazırlayın (adım 1.5).NOT: Aşağıdakiler, gerektiğinde ayarlanabilen 12 delikli bir plakanın (30-50 agrega) bir kuyusu için protokoldür.12 delikli bir plakanın bir kuyucuğu için, alt katman olarak 0,5 mL ECM uygulayın ve üst katmanda 0,5 mL ECM artı agregalar kullanın. Bu, etkili 3D agrega filizlenmesi için gerekli ECM “sandviçini” oluşturur. 500 μL ECM pipetini 12 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin. Kabarcık oluşmadığından ve kuyu alt ve yan menisküsünün tamamen kaplandığından emin olun. Bu, ECM sandviçinin 1. katmanını içerir. Plakayı 2 saat boyunca 37 ° C’ye geri yerleştirin.NOT: Etkili polimerizasyon için 2 saatlik bir süre gereklidir. Daha kısa süre, ECM bütünlüğünü tehlikeye atma riski taşır. Katman 1 polimerizasyonunun sonuna doğru, agregaları her bir kuyucuğun merkezinde toplamak için dairesel bir hareket kullanın, agregaları ve çevresindeki ortamı her bir kuyucuktan nazikçe toplamak için 1 mL’lik bir pipet kullanın ve bunları karşılık gelen 15 mL konik tüplerine yerleştirin. Agregaların 10-15 dakika boyunca yerleşmesine izin verin ve süpernatanı aspire edin. Agregaları 15 mL’lik konik tüpe 5 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. Soğurken, şimdi polimerize edilmiş katman 1 ile 12 delikli plakayı inkübatörden çıkarın.NOT: Agregaların soğutulması, katman 2 ECM’nin erken polimerizasyonunu önlemeye yardımcı olur. Kabarcık oluşumunu önlemek için hızlı ve dikkatli bir şekilde çalışın, agregaları 500 μL ECM’de yeniden askıya alın ve ECM-agrega süspansiyonunu zaten polimerize edilmiş katman 1’in üzerine pipetinleyin. Katman 1’e dokunmamaya dikkat ederek, katman 2’yi ve agregaları kuyunun etrafına nazikçe dağıtmak için 200 μL’lik bir pipet ucu kullanın. Plakayı 2 saat boyunca 37 ° C’ye geri yerleştirin.NOT: Etkili ECM polimerizasyonu için 2 saatlik bir inkübasyon süresi gereklidir. Daha kısa süre, ECM bütünlüğünü tehlikeye atma riski taşır ve katman 1 ile katman 2 arasında güçlü yapışmayı önleyebilir. Kan damarı farklılaşmasını indüklemek için 1 mL önceden ısıtılmış (37 ° C) filizlenme ortamı (adım 1.6) ekleyin. Filizlenen kaplar, gömme işleminden 1 gün ila 3 gün sonra görünmelidir. Ortamı 3 gün sonra ve ardından her gün değiştirin.NOT: Filizlenme ortamı önceden ısıtılmalıdır; aksi takdirde, katman ayrılması meydana gelebilir ve ECM bütünlüğü etkilenebilir. 7. Gün 11 – BVO’ların izolasyonu ve olgunlaşması Steril koşullar altında çalışırken, vasküler ağları içeren ECM filizlenme matrisini gevşetmek için steril bir spatulanın yuvarlak ucunu kullanın. Bu aşamada, jel serbest yüzen bir diske benzemelidir.Steril forseps ve steril bir spatulanın yuvarlak ucunu kullanarak, jel diski (vasküler ağlar dahil) 10 cm’lik bir kültür kabının kapağına dikkatlice aktarın. Kapak artı jeli, istenen büyütme ve odaklanmaya göre ayarlanmış bir stereomikroskop altına yerleştirin ve işlemde elde edilen vaskülarize olmayan ECM miktarını sınırlamaya çalışarak tek kan damarı ağlarını kesmek için steril iğneler kullanın.NOT: Hücreler zamanla çevredeki ECM’yi doğal olarak bozar; Bununla birlikte, her organoid ile kesilen miktarın azaltılması, görüntü kalitesini ve bağımsız gemi ağı bütünlüğünü arttırır. Tüm organoidler jelden izole edildikten sonra, bunları yavaşça 3 mL filizlenme ortamına sahip ultra düşük bir bağlantı 6 delikli plakanın bir kuyucuğuna geri aktarın. Bu aşamada, organoidler gece boyunca bırakılabilir veya biri hemen adım 7.4’e devam edebilir. Tek organoidleri 6 delikli plakadan ultra düşük ataşman 96 delikli plakanın kuyucuklarına aktarmak için 1 mL’lik bir pipet kullanın. Aktarıldıktan sonra, 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 200 μL önceden ısıtılmış (37 ° C) filizlenme ortamı ekleyin.NOT: 12 delikli bir plakadan bir vasküler organoid kuyusu, 96 delikli bir plakanın 30-40 kuyucuğunu doldurmalıdır. 96 delikli plakalarda izolasyondan 4-6 gün sonra, organoidlerin yuvarlak ve sağlıklı bir morfolojiye sahip olduğundan emin olun. Bu aşamada, organoidler sabitlenmeye ve lekelenmeye hazırlanmaya hazırdır. 8. Gün 15 – BVO’ların sabitlenmesi, bloke edilmesi ve boyanması Kesilmiş 1 mL’lik bir uç kullanarak, organoidleri 1,5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Herhangi bir BVO’nun aspirasyonunu önlemeye dikkat ederek, mikrosantrifüj tüpünde kalan filizlenme ortamını çıkarmak için 200 μL veya 1.000 μL pipet kullanın ve ardından PBS’de 1 saat boyunca 1 mL% 4 PFA ekleyin.NOT: Oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcıya (125 rpm) sabitlenmesi önerilir. Maksimum 60 BVO / mikrosantrifüj tüpü kabul edilebilir. Daha fazla BVO, fiksasyonu ve yıkama etkinliğini bozacaktır.DİKKAT: PFA zararlı bir kimyasaldır. Bir duman davlumbazında dikkatli kullanın ve kullanım ve uygun bertaraf yöntemleri için üreticinin talimatlarını izleyin. Yeni sabitlenmiş BVO’ları her seferinde 15 dakika boyunca 3 kez% 0,25 PBS-Arayla yıkayın. Organoidlerin çapı 1 mm’den büyükse, BVO’ları PBS’de% 1 Triton X-100 ile oda sıcaklığında 30-60 dakika geçirgenleştirin. %0,25 PBS-Ara’nın tümünü aspire edin ve 1 mL engelleme arabelleği ekleyin (adım 1,7).NOT: Antikora bağımlı olmasına rağmen, bir orbital çalkalayıcı (125 rpm) üzerinde oda sıcaklığında 2 saat, boyama işlemi sırasında spesifik olmayan antikor bağlanmasını azaltmak için yeterlidir. Organoidler bloke edici tamponda 4 °C’de 2 haftaya kadar bırakılabilir. Bloke edici tamponu çıkarın ve bloke edici tamponun 1 mL’sinde seyreltilmiş birincil antikoru (1:100) ekleyin. Bir orbital çalkalayıcıda (12 rpm) gece boyunca 4 ° C’de tutun, organoidlerin birincil antikor çözeltisine batırılmış kalmasını sağlayın.NOT: Bir gecede primer antikor inkübasyonu, bu çalışmada kullanılan antikorlar için uygundur. Gerekli birincil ve ikincil antikorlar ve bunların ilgili seyreltmeleri Malzeme Tablosunda verilmiştir. Bir gecede primer antikor inkübasyonunu takiben, birincil antikor çözeltisini çıkarın ve% 0.25 PBS-Ara ile her seferinde 15 dakika boyunca 3 kez yıkayın. İkincil antikoru (1:250) artı DAPI’yi (1:1.000) 1 mL bloke edici tamponda seyreltilmiş olarak ekleyin ve oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 °C’de 2 saat inkübe edin.NOT: Numuneler doğru hazırlanmışsa (yukarıda açıklandığı gibi), oda sıcaklığında 2 saat veya gece boyunca 4 ° C’de inkübasyon, bu çalışmada kullanılan antikorlar için uygundur. İnkübasyondan sonra, ikincil antikor çözeltisini çıkarın ve% 0.25 PBS-Ara ile her seferinde 15 dakika boyunca 3 kez yıkayın.NOT: Boyamayı takiben, organoidler PBS’de 2 haftaya kadar tutulabilir. 9. Kan damarı organoidlerinin (BVO’lar) montajı Ara parçaları istenen görüntüleme kapaklarına yapıştırın (bkz. Kesilmiş 1 mm’lik pipet ucu kullanarak, tek organoidleri ara parça kuyucuklarına aktarmak için 1 mL’lik bir pipet kullanın ve kalan PBS’yi aspire edin. Kuyuyu, organoidi tamamen suya batırarak 75 ° C’ye ısıtılmış 150-200 μL temizleme çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile doldurun.NOT: Numuneler, ısıtılmış temizleme çözeltisine maruz kaldıktan sonraki 1 saat içinde berraklaşmalıdır.1 saatlik temizleme süresi yetersizse, organoidleri karanlıkta kapalı bir kutuda oda sıcaklığında 6 saat ila gece boyunca berraklaşmaya bırakın. Numuneyi gece boyunca bırakıyorsanız, kurumasını önlemek için yeterli temizleme çözeltisine sahip olduğundan emin olun. Temizledikten sonra, temizleme solüsyonunu 100-200 μL pipet ucuyla dikkatlice aspire edin. Organoidi ara parçanın ortasına yavaşça manevra ettirin ve kuyu dolana kadar montaj jeli damlaları ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu) (kontrollü bir ısıtma bloğunda 75 ° C’ye ısıtılır). Numuneleri alt ve üst kapak kaymaları arasındaki boşluğa kapatmak için ikinci kapak kaymasını yavaşça montaj ara parçasının üstüne yerleştirin. Montaj jelinin karanlıkta gece boyunca 4 ° C’de kürlenmesine izin verin.NOT: Kürlemeyi takiben, monte edilen numuneleri daha da sızdırmaz hale getirmek için son kat oje kullanılabilir.