JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Generatie van menselijke bloedvatorganoïden uit pluripotente stamcellen

Published: January 20, 2023
doi:
10.3791/64715
,
1School of Biomedical Engineering,University of British Columbia, 2Life Sciences Institute,University of British Columbia, 3Department of Medical Genetics,University of British Columbia, 4Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA)

Summary

Dit protocol beschrijft de generatie van zelforganiserende bloedvaten uit menselijke pluripotente en geïnduceerde pluripotente stamcellen. Deze bloedvatnetwerken vertonen een uitgebreid en verbonden endotheelnetwerk omgeven door pericyten, gladde spieractine en een continu keldermembraan.

Abstract

Een organoïde wordt gedefinieerd als een gemanipuleerd meercellig in vitro weefsel dat zijn overeenkomstige in vivo orgaan zodanig nabootst dat het kan worden gebruikt om gedefinieerde aspecten van dat orgaan in een weefselkweekschaal te bestuderen. De breedte en toepassing van humaan pluripotent stamcel (hPSC)-afgeleid organoïde onderzoek zijn aanzienlijk gevorderd om de hersenen, het netvlies, de traanbuis, het hart, de longen, de darm, de alvleesklier, de nieren en de bloedvaten te omvatten, naast verschillende andere weefsels. De ontwikkeling van methoden voor het genereren van menselijke microvessels, in het bijzonder, heeft de weg geopend voor het modelleren van de ontwikkeling en ziekte van menselijke bloedvaten in vitro en voor het testen en analyseren van nieuwe geneesmiddelen of weefseltropisme bij virusinfecties, waaronder SARS-CoV-2. Complexe en langdurige protocollen zonder visuele begeleiding belemmeren de reproduceerbaarheid van veel van stamcellen afgeleide organoïden. Bovendien vereist de inherente stochasticiteit van organoïde vormingsprocessen en zelforganisatie het genereren van optische protocollen om het begrip van de verwerving en programmering van het lot van cellen te bevorderen. Hier wordt een visueel geleid protocol gepresenteerd voor het genereren van 3D-organoïden voor menselijke bloedvaten (BVO’s) die zijn ontworpen op basis van hPSC’s. Met een continu keldermembraan, vasculaire endotheelcellen en georganiseerde articulatie met muurschilderingscellen, vertonen BVO’s de functionele, morfologische en moleculaire kenmerken van menselijke microvasculatuur. BVO-vorming wordt geïnitieerd door aggregaatvorming, gevolgd door mesoderm en vasculaire inductie. Vasculaire rijping en netwerkvorming worden geïnitieerd en ondersteund door het inbedden van aggregaten in een 3D-collageen en opgeloste keldermembraanmatrix. Menselijke vaatnetwerken vormen zich binnen 2-3 weken en kunnen verder worden uitgebreid in schaalbare kweeksystemen. Belangrijk is dat BVO’s worden getransplanteerd in immuungecompromitteerde muizenanastomose met de endogene muiscirculatie en specificeren in functionele slagaders, aderen en arteriolen. Het huidige visueel geleide protocol zal het onderzoek naar menselijke organoïden bevorderen, met name met betrekking tot bloedvaten in normale ontwikkeling, weefselvascularisatie en ziekte.

Introduction

Vasculaire disfunctie en bloedvatziekten presenteren zich met duidelijke complicaties in orgaanfuncties. Hart- en vaatziekten (CVD) zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak1 en zijn ook de belangrijkste factor die bijdraagt aan de stijgende kosten van de gezondheidszorg in de Verenigde Staten. Het aantal cvd-gevallen neemt jaarlijks toe en het aantal van deze gevallen komt steeds vaker voor in jongere leeftijdsgroepen (20-45 jaar)2. Er zijn meerdere in vivo modellen ontwikkeld om de ontwikkeling en rijping van bloedvaten, vaatziekten en endotheeldisfunctie te onderzoeken 3,4. Momenteel kunnen methoden die enkelvoudige en meervoudige afstammingsgedefinieerde cellen combineren, hetzij afgeleid van stamcellen of geïsoleerd uit volwassen weefsels in vivo, vasculaire netwerken creëren die aspecten van de menselijke vasculaire functie en anatomie repliceren 5,6. Bloedvaten zijn naar voren gekomen als een van de eerste functionele systemen tijdens de ontwikkeling van het mesoderm, en ze organiseren zich ofwel door een proces van assemblage genaamd “vasculogenese” of door expansie en vertakking van reeds bestaande bloedvaten, die “angiogenese” wordt genoemd7.

Gebruikmakend van de kracht van ontwikkelingsbiologie en zelfgestuurde assemblage, rapporteerden Wimmer et al. de eerste zelforganiserende 3D-organoïden van menselijke bloedvaten van hPSC’s die de functionele, morfologische en moleculaire kenmerken van menselijke microvasculatuurvertonen 8. Net als bij menselijke vasculatuur9 worden deze hBVO’s gegenereerd en aanwezig met een endotheel, een doorlopend keldermembraan en omliggende muurschilderingscellen 8,10. De hBVO’s kunnen in vivo worden getransplanteerd en worden geanastomoseerd met de endogene circulatie. Ze kunnen ook in vitro rijping ondergaan en dienen als modellen voor hart- en vaatziekten (d.w.z. diabetes)8 of weefseltropisme bij virusinfecties zoals SARS-CoV-211. Hoewel we eerder een geschreven protocol10 hebben gepubliceerd, bestaat er geen beschikbaar videoprotocol voor deze anders complexe techniek.

Door middel van een beknopte stapsgewijze progressie wordt hBVO-vorming bereikt door aggregaatvorming, mesoderm-inductie met behulp van een WNT-agonist, Chiron (CHIR99021) en botmorfogeen eiwit – 4 (BMP4) 12,13, vasculaire inductie via vasculaire endotheliale groeifactor A (VEGFA) en Forskolin (Fors) 12, en inbedding in een aangepaste kiemmatrix 8,10. Vasculaire rijping en netwerkvorming volgen de inbedding van de aggregaten in de kiemmatrix. Deze menselijke vaatnetwerken vormen zich binnen 2-3 weken en kunnen tot 6 maanden uit de kiemmatrix worden verwijderd en verder worden gekweekt in schaalbare kweeksystemen. Hier worden optisch geleide procedures voorzien voor de vorming en toepassing van van menselijke stamcellen afgeleide vasculatuur.

Protocol

Alle experimenten die hierin werden uitgevoerd, gebruikten de in de handel verkrijgbare H9 humane iPSC-lijn. Gemeenschappelijke commercieel en niet-commercieel beschikbare menselijke pluripotente stamcellijnen (d.w.z. H9, NC8) zijn ook getest en bewezen effectief voor het genereren van menselijke bloedvatorganoïden met behulp van dit protocol. Voor details verwijzen wij u naar onze eerder gepubliceerde rapporten 8,10. 1. Media- en reagensformulering voor de productie van organoïden van menselijke bloedvaten Bereid het aggregatiemedium voor.Meng 40 ml knock-out DMEM/F12 (medium met lage osmolaliteit zonder L-glutamine of HEPES-buffer geoptimaliseerd voor menselijke ESC- en iPSC-groei), 10 ml knock-out serumvervanger (KOSR), 0,5 ml 200 mM L-alanyl-L-glutaminedipeptide in 0,85% NaCl, 0,5 ml niet-essentiële aminozuren (NEAA), 35 μl bèta-mercaptoethanol (BME, 100 μl 2-mercaptoethanol in 10 ml steriele PBS), en Y-27632 (celdoorlatende en selectieve remmer van Rho-geassocieerde, opgerolde spoel die eiwitkinase [ROCK]14 [10 mM] bij 1:200 bevat) (zie tabel met materialen). Bereid N2B27 (N2 en B27 aangevuld basismedium).Meng 25 ml DMEM/F12, 25 ml neurobasale media, 1 ml B27-supplement, 0,5 ml N2-supplement, 250 μl 200 mM L-alanyl-L-glutaminedipeptide in 0,85% NaCl en 35 μl bèta-mercaptoethanol (zie materiaaltabel). Bereid het mesoderm inductiemedium voor.Supplement N2B27 medium met ChiR (12 μM, GSK3a/b remmer stimulerende mesoderm inductie) en BMP-4 (30 ng/ml, MSX2 activator inducerende mesoderm afstamming).OPMERKING: Voorraad (ChiR): 10 mM (gebruik 1:833, of 1,2 μL/ml N2B27). Voorraad (BMP-4): 100 μg/ml (gebruik 1:3333, of 0,3 μl/ml N2B27) (zie materiaaltabel). Bereid vasculair inductiemedium voor.Vul N2B27 medium aan met VEGFA (100 ng/ml) en forskoline (2 μM) (zie materiaaltabel). Bereid de extracellulaire matrix (ECM) voor.Gebruik 1 ml ECM voor één put van een 12-putplaat (voor het insluiten van 30-50 aggregaten). Gebruik van de 1 ml ECM-oplossing die voor elke put wordt gebruikt 0,5 ml om een onderste laag te maken, “laag 1”, die zal dienen als een ECM-fundering, en 0,5 ml plus aggregaten voor de bovenste laag, “laag 2”. Het gebruik van deze aanpak biedt, door de ECM-suspensie, voldoende ruimte en ondersteuning voor de menselijke bloedvatnetwerken om in alle richtingen te ontkiemen.OPMERKING: In totaal bevat 1 ml ECM 500 μl gezuiverd rundercollageen type I, 250 μl opgeloste keldermembraanmatrix uitgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm-muizensarcoomcellen (zie tabel met materialen) en 250 μl basische matrixoplossing (stap 1.5.2). Bereid het vers en bewaar het op ijs totdat het klaar is voor gebruik. Om de basismatrixoplossing voor vier 12-wells platen (48 putten) te bereiden, mengt u 5,627 ml 0,1 N NaOH, 2,498 ml 10x DMEM, 473 μL HEPES, 368 μL 7,5% natriumbicarbonaat, 233 μL 200 mM L-alanyl-L-glutaminedipeptide in 0,85% NaCl en 3,451 ml Ham’s F-12 (zie materiaaltabel).OPMERKING: De overgebleven basismatrixoplossing kan in een afgedekte polypropyleen conische buis van 50 ml met hoge helderheid worden geplaatst en bij 4 °C worden bewaard voor gebruik gedurende maximaal 2 maanden. Bereid het kiemmedium voor.Formuleer specifiek 50 ml flexibel serumvrij medium (SFM) ter ondersteuning van de ontwikkeling van menselijke hematopoietische cellen, een aliquot van 1,3 ml van het flexibele serumvrije medium voedingssupplement, 15% foetaal runderserum (FBS), 250 μl penicilline-streptomycine, 500 μl van 200 mM L-alanyl-L-glutaminedipeptide in 0,85% NaCl, VEGFA (100 ng / ml) en FGF2 (100 ng / ml) (zie materiaaltabel). Bereid de blokkeringsbuffer voor.Meng 0,5 g runderserumalbumine, 1,5 ml foetaal runderserum, 250 μl Tween 20, 250 μL Triton X-100, 500 μL natriumdeoxycholaat (1% wt/vol bouillon) en 47,5 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (zie materiaaltabel). Pipetteer op en neer totdat alle componenten goed zijn opgenomen en de oplossing duidelijk is. 2. Onderhoud en kweek van menselijke pluripotente en geïnduceerde pluripotente stamcellen Voer celkweek uit met behulp van LDEV-vrije keldermembraanmatrix met verlaagde groeifactor (1:50 verdunning) gecoate 6-well weefselkweekplaten met stamcelkweekmedium (zie materiaaltabel). Zodra de cellen ~ 70% confluentie bereiken, passeert u ze met behulp van 1 ml zoogdierceldissociërend enzym (zie tabel met materialen) gedurende 3-4 minuten bij 37 ° C.OPMERKING: Het splitsen van de cellen in een verhouding van 1:6 verbetert de levensvatbaarheid van de cel en bereikt confluentie binnen 2-4 dagen voor de meeste menselijke stamcellijnen. Om de levensvatbaarheid van de cel te vergroten, wordt rockremmer Y-27632-aangevuld (10 mM, 1:1.000) kweekmedium gebruikt voor 24 uur na het passeren. Verander het kweekmedium dagelijks totdat een samenvloeiing van 70% is bereikt.OPMERKING: Voor de huidige studie, bij 70% confluentie, bevat één put van een 6-well celkweekplaat ongeveer 1 miljoen H9 hPSC’s. 3. Dag 0 – Generatie van pluripotente aggregaten uit een eencellige suspensie OPMERKING: Een samenvloeiing van 70% in twee putten van een 6-well kweekplaat levert ongeveer 175 hBVO’s op. Gebruik een pipet of vacuümsysteem om het kweekmedium op te zuigen, te vervangen door 1 ml celdissociatiereagens (zie materiaaltabel) en gedurende 5 minuten bij 37 °C te incuberen. Terwijl de cellen zich onder het celdissociatiereagens bevinden, bereidt u het benodigde volume aggregatiemedium (stap 1.1) voor in een conische buis van 15 ml indien nodig voor het gewenste aantal putten in een 6-well ultra-low attachment cultuurplaat (zie tabel met materialen). Zuig het 1 ml celdissociatiereagens op en suspensie de cellen in 1 ml aggregatiemedium. Maak een eencellige suspensie met voorzichtig pipetteren naar boven en neer voordat u de monsters telt.LET OP: hPSC’s zijn vrij gevoelig voor mechanische belasting en kunnen geen agressief pipetteren verdragen. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerd celtelapparaat10 of een gestandaardiseerd systeem onder een microscoop. Bereken het celnummer dat nodig is voor het experiment.OPMERKING: Afhankelijk van de cellijn wordt 200.000 cellen/put tot 300.000 cellen/put als ideaal beschouwd voor aggregaatvorming (d.w.z. 4 putten = 800.000 tot 1.200.000 cellen in totaal). Voeg het juiste volume van de celsuspensie toe aan het aggregatiemedium in de 15 ml zeer heldere polypropyleen conische buis. Pipetteer de verdunde celsuspensie voorzichtig op en neer om een homogene celverdeling te garanderen. Pipetteer 3 ml van de verdunde celsuspensie in elk gewenst putje van de 6-well ultra-low attachment cultuurplaat. Plaats de plaat in de incubator (37 °C, 5% CO2, >90% vochtigheid) en vermijd het openen en sluiten van de incubatordeuren zoveel mogelijk.OPMERKING: Deze eerste stap kan het beste worden voltooid in de avonduren of tijdens weinig incubatorverkeer. Zelfs lichte trillingen kunnen de grootte en vorm van de aggregaten beïnvloeden, wat de resultaten kan aantasten. 4. Dag 1 – Mesoderm inductie van aggregaten Zorg ervoor dat 24 uur na het zaaien kleine aggregaten van 2-10 cellen zichtbaar zijn onder de microscoop. Verzamel de aggregaten en laat ze bezinken voordat u het medium verandert in het mesoderm-inductiemedium (stap 1.3). Plaats één 15 ml zeer heldere polypropyleen conische buis per put van de 6-well ultra-low attachment cultuurplaat. Gebruik een cirkelvormige beweging (d.w.z. zoals een orbitale schudder) om de aggregaten in het midden van elke put te verzamelen, gebruik een pipet van 1 ml om de aggregaten en het omringende medium voorzichtig uit elke put te verzamelen, plaats ze in hun overeenkomstige 15 ml zeer heldere polypropyleen conische buizen en laat de aggregaten bij kamertemperatuur bezinken. Eenmaal verzameld, stel een timer in voor 1 uur, wat de tijd is die nodig is voor de meeste cellijnen / aggregaten om in dit stadium te bezinken.OPMERKING: Als de tijd minder dan 1 uur is, kan men alle aggregaten verliezen die zich mogelijk niet op de bodem van de 15 ml conische buis hebben gevestigd. Zodra het uur is verstreken, zuigt u het supernatant voorzichtig op met een pipet of een zeer gevoelige aanzuigpomp. Zorg ervoor dat de aggregaten ongestoord blijven aan de onderkant van de conische buis van 15 ml. Resuspendeerde de aggregaten van elke 15 ml conische buis in 2 ml mesoderm inductiemedium en plaats ze terug in hun respectievelijke putjes van de 6-well ultra-low attachment cultuurplaat. Plaats de plaat terug in de couveuse (37 °C) en laat deze staan tot dag 4.OPMERKING: Als de aggregaten zich hechten en op of in elkaar groeien, pipetteer dan met behulp van een pipet van 1 ml elke put met aggregaten eenmaal per dag voorzichtig op en neer om de aggregaten even groot te houden. 5. Dag 4 – Vasculaire inductie en priming van de aggregaten Verzamel de aggregaten en laat ze bezinken voordat u het medium in het vasculaire inductiemedium verandert (stap 1.4). Plaats één conische buis van 15 ml per put van de 6-well ultra-low attachment cultuurplaat. Gebruik een cirkelvormige beweging (d.w.z. zoals een orbitale schudder) om de aggregaten in het midden van elke put te verzamelen, gebruik een pipet van 1 ml om de aggregaten en het omringende medium voorzichtig uit elke put te verzamelen en plaats ze in hun overeenkomstige 15 ml conische buizen. Eenmaal verzameld, stelt u een timer in voor 30 minuten om de aggregaten te laten bezinken.OPMERKING: Voor de meeste cellijnen is in dit stadium een tijd van 30 minuten vereist. Als de tijd minder dan 30 minuten is, bestaat het risico dat aggregaten verloren gaan die zich mogelijk niet op de bodem van de conische buis van 15 ml hebben gevestigd. Na 30 minuten, met de nodige voorzichtigheid, zuig het supernatant op met een pipet of een zeer gevoelige aanzuigpomp. Zorg ervoor dat de aggregaten ongestoord blijven aan de onderkant van de conische buis van 15 ml. Resuspendeer de aggregaten van elke 15 ml conische buis in 2 ml vasculair inductiemedium en plaats ze terug in hun respectievelijke putjes van de 6-well ultra-low attachment cultuurplaat. Plaats de plaat terug in de couveuse (37 °C) en laat deze staan tot dag 6.OPMERKING: Gebruik een pipet van 1 ml en pipetteer elke put met aggregaten eenmaal per dag voorzichtig op en neer om de aggregaten even groot te houden en te voorkomen dat ze in elkaar groeien of zich aan elkaar hechten. 6. Dag 6 – Aggregaat inbedding en kiemen van vaten inductie Bereid tijdens het werken op ijs het gewenste eindvolume van de ECM-oplossing voor (stap 1.5).OPMERKING: Het volgende is het protocol voor één put van een 12-putplaat (30-50 aggregaten), die indien nodig kan worden aangepast.Breng voor één put van een plaat met 12 putten 0,5 ml ECM aan als onderste laag en gebruik 0,5 ml ECM plus aggregaten op de bovenste laag. Hierdoor ontstaat de ECM “sandwich” die nodig is voor een effectieve 3D-aggregaatkieming. Pipetteer 500 μL ECM in één putje van een plaat met 12 putten. Zorg ervoor dat er geen bubbels worden gevormd en dat de bodem en de meniscus aan de zijkant volledig zijn gecoat. Deze bestaat uit laag 1 van de ECM sandwich. Plaats de plaat gedurende 2 uur terug op 37 °C.OPMERKING: Een tijd van 2 uur is nodig voor effectieve polymerisatie. Elke kortere tijd riskeert de ECM-integriteit in gevaar te brengen. Gebruik tegen het einde van de polymerisatie van laag 1 een cirkelvormige beweging om de aggregaten in het midden van elke put te verzamelen, gebruik een pipet van 1 ml om de aggregaten en het omringende medium voorzichtig uit elke put te verzamelen en plaats ze in hun overeenkomstige 15 ml conische buizen. Laat de aggregaten 10-15 minuten bezinken en zuig het supernatant op. Plaats de aggregaten in de 15 ml conische buis op ijs gedurende 5 minuten. Haal tijdens het afkoelen de 12-well plaat met de nu gepolymeriseerde laag 1 uit de incubator.OPMERKING: Het koelen van de aggregaten helpt vroege polymerisatie van de laag 2 ECU te voorkomen. Snel en voorzichtig werken om bellenvorming te voorkomen, de aggregaten in 500 μL ECM resuspenderen en de ECM-aggregaatsuspensie bovenop de reeds gepolymeriseerde laag 1 pipetteren. Wees voorzichtig om laag 1 niet aan te raken en gebruik een pipetpunt van 200 μL om laag 2 en de aggregaten voorzichtig rond de put te verdelen. Plaats de plaat gedurende 2 uur terug op 37 °C.OPMERKING: Een incubatietijd van 2 uur is noodzakelijk voor effectieve ECM-polymerisatie. Elke kortere tijd kan de ECM-integriteit in gevaar brengen en kan een sterke hechting tussen laag 1 en laag 2 voorkomen. Voeg 1 ml voorverwarmd (37 °C) kiemmedium (stap 1.6) toe om de bloedvatdifferentiatie te induceren. Kiemvaten moeten 1 dag tot 3 dagen na inbedding verschijnen. Vervang het medium na 3 dagen en vervolgens om de andere dag.OPMERKING: Het kiemmedium moet worden voorverwarmd; anders kan laagloslating optreden en kan de ECM-integriteit worden beïnvloed. 7. Dag 11 – Isolatie en rijping van de BVO’s Gebruik onder steriele omstandigheden het afgeronde uiteinde van een steriele spatel om de ECM-kiemmatrix met de vasculaire netwerken los te maken. In dit stadium moet de gel lijken op een vrij zwevende schijf.Breng met behulp van een steriele tang en het afgeronde uiteinde van een steriele spatel de gelschijf (inclusief de vasculaire netwerken) voorzichtig over naar het deksel van een kweekschaal van 10 cm. Plaats het deksel plus gel onder een stereomicroscoop die is aangepast aan de gewenste vergroting en focus, en gebruik steriele naalden om afzonderlijke bloedvatnetwerken uit te snijden, in een poging de hoeveelheid niet-gevasculariseerde ECM die tijdens het proces wordt verkregen, te beperken.OPMERKING: De cellen breken de omringende ECM in de loop van de tijd op natuurlijke wijze af; Het verminderen van de hoeveelheid uitsparing met elke organoïde verhoogt echter de beeldkwaliteit en de integriteit van het vrijstaande scheepsnetwerk. Zodra alle organoïden uit de gel zijn geïsoleerd, brengt u ze voorzichtig terug in één put van een ultralage aanhechtingsplaat met 6 putten met 3 ml kiemmedium . In dit stadium kunnen de organoïden ‘s nachts worden achtergelaten, of men kan onmiddellijk doorgaan met stap 7.4. Gebruik een pipet van 1 ml om enkele organoïden over te brengen van de 6-putplaat naar de putjes van een ultralage 96-putplaat. Voeg na overdracht 200 μL voorverwarmd (37 °C) kiemmedium toe aan elk putje van de 96-putplaat.OPMERKING: Een put van vasculaire organoïden van een 12-putplaat moet 30-40 putten van een 96-putplaat vullen. Zorg er 4-6 dagen na isolatie in de 96-putplaten voor dat de organoïden een ronde en gezonde morfologie bezitten. In dit stadium zijn de organoïden klaar om te worden gefixeerd en voorbereid op kleuring. 8. Dag 15 – Fixatie, blokkering en kleuring van de BVO’s Gebruik een gesneden punt van 1 ml en breng de organoïden over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Wees voorzichtig om de aspiratie van BVO’s te vermijden, gebruik een pipet van 200 μL of 1.000 μL om het resterende kiemmedium in de microcentrifugebuis te verwijderen en voeg vervolgens 1 ml 4% PFA toe in PBS gedurende 1 uur.OPMERKING: Fixatie op een orbitale shaker (125 rpm) bij kamertemperatuur wordt aanbevolen. Een maximum van 60 BVO’s/microcentrifugebuis is acceptabel. Nog meer BVO’s zullen de fixatie en waseffectiviteit aantasten.LET OP: PFA is een schadelijke chemische stof. Gebruik het met voorzichtigheid in een zuurkast en volg de aanwijzingen van de fabrikant voor gebruik en geschikte verwijderingsmethoden. Was de nieuw vaste BVO’s telkens 3x gedurende 15 min met 0,25% PBS-Tween. Als de organoïden groter zijn dan 1 mm in diameter, permeabiliseer de BVO’s dan met 1% Triton X-100 in PBS gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur. Zuig alle 0,25% PBS-Tween aan en voeg 1 ml blokkeringsbuffer toe (stap 1.7).OPMERKING: Hoewel antilichaamafhankelijk, is 2 uur bij kamertemperatuur op een orbitale shaker (125 rpm) voldoende om de niet-specifieke antilichaambinding tijdens het kleuringsproces te verminderen. De organoïden kunnen tot 2 weken in de blokkeringsbuffer bij 4 °C worden bewaard. Verwijder de blokkeringsbuffer en voeg het primaire antilichaam (1:100) verdund in 1 ml van de blokkeringsbuffer toe. Houd ‘s nachts bij 4 °C op een orbitale shaker (12 rpm), zodat de organoïde (en) ondergedompeld blijven in de primaire antilichaamoplossing.OPMERKING: ‘s Nachts primaire antilichaamincubatie is geschikt voor de antilichamen die voor dit onderzoek worden gebruikt. De benodigde primaire en secundaire antilichamen en hun respectieve verdunningen zijn opgenomen in de materiaaltabel. Verwijder na de nachtelijke primaire antilichaamincubatie de primaire antilichaamoplossing en was 3x gedurende 15 minuten elke keer met 0,25% PBS-Tween. Voeg het secundaire antilichaam (1:250) plus DAPI (1:1.000) verdund in 1 ml blokkeringsbuffer toe en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of bij 4 °C gedurende een nacht.OPMERKING: Als de monsters correct worden bereid (zoals hierboven beschreven), is incubatie gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of bij 4 °C ‘s nachts geschikt voor de antilichamen die in dit onderzoek worden gebruikt. Verwijder na de incubatie de secundaire antilichaamoplossing en was 3x gedurende 15 minuten elke keer met 0,25% PBS-Tween.OPMERKING: Na de kleuring kunnen de organoïden maximaal 2 weken in PBS worden bewaard. 9. Montage van de bloedvatorganoïden (BVO’s) Lijm montageafstandhouders op de gewenste imaging coverslips (zie Materiaaltabel). Gebruik een gesneden pipetpunt van 1 mm om een pipet van 1 ml over te brengen om enkele organoïden in de afstandsputten over te brengen en de resterende PBS op te zuigen. Vul de put met 150-200 μL opruimoplossing (zie materiaaltabel) verwarmd tot 75 °C, waarbij de organoïde volledig wordt ondergedompeld.OPMERKING: De monsters moeten helder worden binnen 1 uur na blootstelling aan de verwarmde opruimoplossing.Laat de organoïden helder worden in een afgedekte doos in het donker bij kamertemperatuur gedurende 6 uur tot een nacht als de opruimtijd van 1 uur onvoldoende is. Als u het monster een nacht laat staan, zorg er dan voor dat het voldoende opruimoplossing heeft om uitdroging te voorkomen. Na het opruimen zuigt u de opruimoplossing voorzichtig op met een pipetpunt van 100-200 μL. Manoeuvreer de organoïde voorzichtig naar het midden van de afstandshouder en voeg druppels montagegel toe (zie materiaaltabel) (opgewarmd tot 75 °C in een gecontroleerd verwarmingsblok) totdat de put vol is. Plaats de tweede coverslip voorzichtig bovenop de montageafstandhouder om de monsters af te dichten in de ruimte tussen de onderste en bovenste coverslips. Laat de montagegel in het donker uitharden bij 4 °C een nacht.OPMERKING: Na het uitharden kan topcoat nagellak worden gebruikt om de gemonteerde monsters verder af te dichten.

Representative Results

De stappen die in dit protocol worden beschreven, zijn specifiek ontwikkeld om een gecontroleerde en nauwkeurige methode op te leveren voor het genereren van menselijke bloedvatorganoïden uit hPSC’s. Het genereren van aggregaten met een diameter van 30-100 μm uit hPSC-culturen markeert het startpunt van het protocol (figuur 1, figuur 2B). De aggregaten worden geleid door stapsgewijze inducties naar mesoderm (dag 1-dag 4) en vasculaire afstammingslijnen (dag 4-dag 6) voorafgaand aan inbedding (dag 6) (figuur 2A-D), wat nodig is voor de vorming van het vaatnetwerk. De ontkieming van bijna-radiaal symmetrische vaten moet zichtbaar zijn met d7 of d8 (figuur 2E) en doorlopen tot en met d10 (figuur 2F,G). De explantatie van de hBVO’s van de ECU naar de 96-well ultra-low attachment plates vermindert de kwetsbaarheid van de kiemnetwerken en maakt continu onderhoud in suspensiecultuur (figuur 2H) gedurende maximaal 6 maanden mogelijk. Tegen d15 vertonen de hBVO’s een uitgebreid en verbonden endotheelnetwerk (CD31+) omgeven door pericyten (PDGFR-ß+) en gladde spieractine (SMA+) (figuur 3A-D). Een continu collageen IV (ColIV+) keldermembraan omhult de vaatnetwerken (figuur 3E). Endotheelcellen (CD31+, VE-Cadherin+) en pericyten (PDGFR-ß+) vormen respectievelijk ongeveer 30%-35% en 60%-65% van de organoïde celpopulaties8. Het actief ontkiemen van de vaten vindt plaats onder leiding van een endogeen georganiseerde tipcel (CD31+) populatie die zich presenteert met typische tipcelmorfologie, zoals overmatige filipodia 8,10. De presentatie van PDGFR-ß+ en SMA+ muurschilderingscellen die de endotheelvatnetwerken inkapselen, is te zien aan d15 van het organoïde rijpingsproces (figuur 3A,C). Na verwijdering uit de ECM en rijping in suspensiecultuur (d.w.z. d15) zijn de hBVO’s houdbaar voor respectievelijke analyses of transplantatie onder de niercapsule van de muis. Figuur 1: Schema van het hVVO-protocol met de timing en stapsgewijze progressie. Van schijnbaar homogene hPSC- of hiPSC-culturen vindt aggregaatvorming plaats in aanwezigheid van de Rho-kinaseremmer Y27632. BMP4 en CHiR-aangevuld medium wordt gebruikt om de aggregaten te instrueren naar het mesodermale lot. Mesoderm inductiemedium wordt vervangen door VEGFA en forskoline-aangevuld medium om de aggregaten te stimuleren in de richting van een vasculaire afstamming. Mechanische en chemische wachtrijen bereikt door de inbedding van de aggregaten in een collageen I en opgeloste keldermembraanmatrix en blootstelling aan VEGFA- en FGF2-bevattend medium resulteert in bijna radiaal symmetrische vasculaire ontkieming uit het aggregaatlichaam. De gegenereerde vaatnetwerken kunnen worden verwijderd uit het collageen I en het opgeloste keldermembraan en in suspensiecultuur worden geplaatst voor verdere rijping, analyse of transplantatie in vivo. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Stapsgewijze progressie van de hBVO-generatie vastgelegd onder brightfield. (A) Typische morfologie van hPSC (H9) kolonies op dag −1. (B) Generatie van hPSC-aggregaten (dag 0) op 6-well ultra-low attachment plates in aanwezigheid van Y-27632. (C) De mesodermale inductie van aggregaten met behulp van BMP4 en ChiR-aangevuld medium (dag 1). Subtiele veranderingen in de totale grootte en vorm kunnen ook worden waargenomen. (D) Dag 4 aggregaten geprepareerd op een vasculaire afstamming met behulp van VEGFA en forskoline-aangevuld medium. (E) Vroege kiemvaten op dag 7, één dag na inbedding van de aggregaten in de kiemmatrix en blootstelling aan VEGFA en FGF2-aangevuld kiemmedium (dag 7). (F) Gezonde organoïde morfologie en voortgezette vaatkieming op dag 9. (G) Laat stadium van het schip dat op dag 10 ontkiemt. Idealiter zijn de dichte celstructuren in het organoïde centrum tegen die tijd verdwenen. (H) Typische morfologie van volwassen (dag 15) menselijke bloedvatorganoïden. De verwijdering van de omringende matrix door snijden en rijping in ultralage aanhechtingskweekplaten met 96 putten vormt de organoïden bolvormig, waarbij de vaatnetwerken intern zijn ondergebracht. Schaalstaven: (A,B,E,F) 250 μm; (C,D) 500 μm; (G,H) 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Whole-mount kleuring van volwassen (dag 15) menselijke bloedvat organoïden. (A) Presentatie van volwassen (dag 15) menselijke bloedvatorganoïden met zelfgeorganiseerde endotheel (CD31+, magenta) netwerken en omliggende pericyten (PDGFR-β+, cyaan) en alfa-gladde spieractine (SMA+, geel) dekking. (B) Hogere vergroting van A met details over de SMA+ (geel) en PDGFR-β+ (cyaan) expressie van de scheepsnetwerken. (C) Gedetailleerde presentatie van endotheel (CD31+, magenta), pericyt (PDGFR-β+, cyaan) en alfa-gladde spieractine (SMA+, geel) interactie. (D) Whole-mount kleuring van de vaat endotheliale (CD31 +, magenta) – gladde spier (SMA +, geel) interactie in een doorsnede (links) en een hogere vergroting (rechts) van volwassen bloedvat organoïden. (E) Zelfgestuurde vorming van een vasculaire keldermembraan (Col IV +, grijswaarden) door de nauwe associatie van de muurschilderingscellen en endotheelbuizen. Schaalbalken: (A,D[links]) 100 μm; (B,D[rechts],E) 25 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Recente doorbraken in van stamcellen afgeleide organoïde culturen hebben het kader geboden voor meer geavanceerde en fysiologisch relevante modellen van menselijke vasculatuur. Het hier gepresenteerde humane bloedvatorganoïde (hBVO) model, ontwikkeld in ons laboratorium 8,10, biedt een krachtig middel om niet alleen verdere aspecten van menselijke vasculogenese te verkennen, maar ook nieuwe wegen van ziektemodellering en regeneratieve therapie 8,10,11. Meerdere in vivo modellen zijn gebruikt om de ontwikkeling en rijping van bloedvaten, vaatziekten en endotheeldisfunctie te onderzoeken 3,4. Verschillende benaderingen combineren enkelvoudige en meervoudige afstammingsgedefinieerde cellen, hetzij afgeleid van stamcellen of geïsoleerd uit volwassen weefsels in vivo om replicatieve menselijke vasculaire netwerken te creëren 5,6. Het hier gepresenteerde protocol maakt gebruik van het principe van ontwikkelingsbiologie en zelforganisatie om de allereerste multi-cell lineage menselijke bloedvatnetwerken op te leveren die in wezen kunnen worden gegenereerd uit een enkele hPSC 8,10.

Elke stamcellijn heeft een unieke genetische samenstelling en verschilt van andere in termen van herkomst, functie en reactievermogen15. Daarom is het protocol voor humane bloedvatorganoïden (hBVO’s) ontwikkeld en geoptimaliseerd om een robuuste en reproduceerbare protocolcompatibiliteit met meerdere (>12) verschillende hPSC-lijnen 8,10 te garanderen. De hier beschreven methode genereert hPSC-afgeleide bloedvatorganoïden gedurende 2 weken. Veranderingen in de mediasamenstelling en of de technieken in hBVO-generatie kunnen echter leiden tot een ineffectief vaatnetwerk en organoïdegeneratie. De variërende proliferatiesnelheden van individuele stamcellijnen hebben ook een duidelijke invloed op de reproduceerbaarheid van stamcelexperimenten15 en dus organoïde culturen. Bij het genereren van de BVO’s zijn bijvoorbeeld meer proliferatieve cellen of hogere aantallen grote dag 1-aggregaten inherent onderhevig aan verschillende metabolische omgevingen en gas- en nutriëntendiffusieparameters. Dit verandert op zijn beurt de blootstellingstijden en efficiëntie van de groeifactor, de mate van differentiatie en vasculaire priming, en, belangrijker nog, het vermogen om vaatnetwerken te vormen bij het inbedden van de aggregaten in de collageen 1 en opgeloste keldermembraanmatrix.

De passieve diffusie van zuurstof en de toediening van essentiële voedingsstoffen uit een externe omgeving is niet ideaal voor de langdurige celgroei van 3D-organoïden en weefselmorfogenese in vitro16. Hoewel afhankelijk van verschillende factoren (d.w.z. de weefselstofwisseling, de biologische beschikbaarheid van voedingsstoffen en gassen, een statische of dynamische omgeving), is een algemene limiet van 150 μm O2 en diffusie van voedingsstoffen vastgesteld voor weefsels die in vitro zijn gekweekt, aangezien menselijke weefsels fysiologisch gezien koorden van levende cellen binnen 150 μm van doordrenkte bloedvaten vertonen17. Hoewel effectieve gas- en nutriëntendiffusieafstanden van 70-200 μm ook zijn voorgesteld18,19,20,21, hebben de constructdichtheid, temperatuur, pH en mediasamenstelling een aanzienlijke invloed op de diffusie-efficiëntie. Door de optimalisatie van het oppervlak en de integrine-bètareceptorcommunicatie na de inbedding van dag 6, presteren aggregaten met een diameter van 250-300 μm beter dan die met een diameter van >500-600 μm, wat resulteert in een compleet kiemproces en een minimaal gecondenseerde organoïde kern. De aggregaatgrootte is dus cruciaal en kan worden beïnvloed door zowel het aantal cellen dat tijdens het eerste zaaien wordt gebruikt als de tijd die is toegewezen voor aggregaatvorming. Microwell-platen die controle mogelijk maken over de aggregaatgrootte en nummer22 zijn een levensvatbaar alternatief voor de anders stochastische aggregaatvormingstechniek die voortvloeit uit het gebruik van ultralage bevestiging 6-putplaten in dit protocol. Consistentie in timing en het beheren van de geaggregeerde groottes tijdens de eerste 6 dagen van het hVVO-protocol is een van de, zo niet de meest cruciale indicatoren voor het succesvol ontwikkelen van bonafide bloedvatorganoïden.

Mediumveranderingen op dag 1 (mesoderminductie) en dag 4 (vasculaire inductie) moeten worden voltooid in combinatie met de sedimentatie van de aggregaten. Hoewel centrifugatie een verleidelijk alternatief is, kunnen de extra krachten die worden uitgeoefend op de zwak geassembleerde aggeraten ongewenste klonteringen, assemblage en afschuiving veroorzaken, wat een negatieve invloed heeft op differentiatie, rijping en kiemefficiëntie in de latere stadia van het protocol. Werken op ijs tijdens het inbeddingsproces van dag 6 is van cruciaal belang voor het behoud van een goede ECM-polymerisatie en laagvorming. Tijdens de inbedding en kieminductie van het aggregaat zal het blootstellen van de ECM aan temperaturen boven 4 °C en/of een andere ECM pH dan 7,4 niet alleen de polymerisatiesnelheden en de integriteit van de ECM-laag beïnvloeden, maar ook de kiemefficiëntie van de ingebedde aggregaten. De elastische aard van de ECM-kiemmatrix maakt het gemakkelijk om los te maken en te transporteren van de 12-well kweekschaal naar het steriele snijoppervlak. Individuele organoïden die uit de matrix worden verwijderd en worden overgebracht naar ultralage hechtingsplaten met 96 putten, verbruiken de resterende omringende ECM en behouden zelfgeorganiseerde muurschilderingscelgecoate endotheliale microvelannetwerken met een continu keldermembraan.

Hoewel niet behandeld in dit voorstel, kunnen wijzigingen in de mediasamenstellingen ziekten repliceren die op hun beurt pathologische reacties veroorzaken in hBVOs 8,11. De grenzen van ziektemodellering met behulp van het hBVO-systeem zijn verre van bekend, en dit is zeker een gebied dat moet worden onderzocht. De toepassing van onze bloedvatorganoïde technologie in de vascularisatie van voorheen avasculaire organoïde constructen23 is ook van aanzienlijke impact en belang.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken alle leden van onze laboratoria voor hun kritische inbreng en discussies. JMP ontving financiering van de T. von Zastrow Foundation, de FWF Wittgenstein-prijs (Z 271-B19), de Oostenrijkse Academie van Wetenschappen, de Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking (JU) onder subsidieovereenkomst nr. 101005026, Leducq Transatlantic Networks of Excellence in Cardiovascular Research, Allen Institute Distinguished Investigator Program en het Canada 150 Research Chairs Program F18-01336, evenals de Canadian Institutes of Health Research COVID-19-subsidies F20-02343 en F20-02015.

Materials

1 M HEPES  Gibco 15630080
2-Mercaptoethanol Millipore 60-24-2
7.5% sodium bicarbonate Gibco 5080094
Accutase  Gibco A1110501 cell dissociation reagent 
Albumin fraction V (BSA) AppliChem A1391, 0100
Alexa Fluor 488–anti-rabbit IgG (Fab′)2 fragment — Jackson Immuno Research 711-546-152
Alexa Fluor 488–anti-sheep IgG — Life Technologies A11015
Alexa Fluor 647–anti-goat IgG (Fab′)2 fragment — Jackson Immuno Research 705-606-147
Automated cell counter  Invitrogen Countess II
B27 supplement Gibco 12587010
Biological safety cabinet  Faster SafeFAST Premium 212
BMP4 Miltenyi BioTec 130-111-165
CD31 Endothelial cell DAKO M0823
CD31 Endothelial cell R&D AF806
Cellulose wipes
Centrifuge Heraeus Multifuge 4 KR
CHIR99021 Tocris Bioscience 4423
Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure)
CO2 incubator  New Brunswick Galaxy 170S
Collagen type IV Basement membrane Millipore AB769
Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives) Leica SP8
Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue Invitrogen C10283
Coverslips (22 x 50 mm)
Cy3–anti-mouse IgG (Fab′)2 fragment — Jackson Immuno Research 715-166-150
DAPI  Sigma D9542
DMEM/F12 Gibco 11330-032
Dulbecco's Modefied Eagle's Medium (DMEM)  Sigma D5648-10L
Eppendorf tubes
Falcon tubes Fisher Scientific 14-432-22
Fetal Bovien Serum (FBS) Gibco 10270-106
FGF2 Miltenyi BioTec 130-093-841
Fine forceps FST 11254-20
Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides Fisher Scientific 12-550-016
Forskolin  Sigma F3917
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Fisher Scientific A1413302
Glutamax Gibco 35050061
Ham's F12  Gibco 11765054
Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC  Thermo Scientific Heraguard
Inverted contrasting tissue culture microscope  Zeiss Vert.A1
iSpacer  SunJinLab IS009
KnockOut DMEM/F12  Gibco 12660012
KnockOut Serum Replacement  Gibco 10828028
N2 supplement  Gibco 17502048
Neurobasal medium Gibco 21103049
non-essential amino acids (NEAAs) Gibco 11140035
Orbital shaker
Parafilm
Paraformaldehyde (4%) in PBS Boston BioProducts BM-155
PDGFR-β Pericyte R&D AF385
PDGFR-β Pericyte Cell Signaling 3169S
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
pH indicator strips (6.5-10) Mquant, Millipore 109543
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Pipettes (P1000, P200 and P20) Gilson, Integra Pipetboy
Prime Surface-U 96-well plates  Sumilon MS9096-U
PurCol  Advanced BioMatrix 5005
RapiClear CS gel SunJinLab RCCS005
RapiClear CS mounting solution SunJinLab RCCS002
Serological pipettes (5, 10 and 25 mL) Falcon 357529, 357530, 357515
SMA vSMC/Pericyte Sigma 2547
Sodium deoxycholate Sigma D6750
Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N) Sigma S2770
Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel) Corning 356231
Stainless steel micro spatula (rounded end) Fisher Scientific 21-401-5
Stainless steel spoon (double-ended) Fisher Scientific BelArt H367290018
Stemflex medium Thermo Scientific A3349401 stem cell culture medium 
StemPro-34 SFM Gibco 10639011 flexible serum-free medium 
Stereomicroscope Zeiss Stemi 2000
Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 μL) Biozym, Surphob VT0270, VT0250, VT0220
Tissue culture–treated 12-well plates TC  BD Falcon 353043
Tissue culture–treated 6-well plates  Eppendorf 30720113
Triton X-100  Sigma 93420
Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red Thermo Scientific 12605010 mammalian cell dissociating enzyme 
Tween 20 Sigma P7949
Ultra-low-attachment 6-well plates Corning  3471
VEGFA  Peprotech 100-20
Water bath (37 °C) Fisher Scientific Isotemp 210
Y-27632 Calbiochem 688000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Okwuosa, I. S., Lewsey, S. C., Adesiyun, T., Blumenthal, R. S., Yancy, C. W. Worldwide disparities in cardiovascular disease: Challenges and solutions. International Journal of Cardiology. 202, 433-440 (2016).
  2. Page, R. L., Ghushchyan, V., Nair, K. A call to action: Responding to the future forecasting of cardiovascular disease in America. American Health & Drug Benefits. 4 (5), 280-288 (2011).
  3. Ferrara, N., Davis-Smyth, T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocrine Reviews. 18 (1), 4-25 (1997).
  4. Ishitobi, H., et al. Flk1-GFP BAC Tg mice: An animal model for the study of blood vessel development. Experimental Animals. 59 (5), 615-622 (2010).
  5. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  6. Xu, Y., et al. A novel strategy for creating tissue-engineered biomimetic blood vessels using 3D bioprinting technology. Materials. 11 (9), 1581 (2018).
  7. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  8. Wimmer, R. A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).
  9. Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. From arteries to capillaries: Approaches to engineering human vasculature. Advanced Functional Materials. 30 (37), 1910811 (2020).
  10. Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (11), 3082-3100 (2019).
  11. Monteil, V., et al. Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2. Cell. 181 (4), 905-913 (2020).
  12. Patsch, C., et al. generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  13. Bruveris, F. F., Ng, E. S., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. VEGF, FGF2, and BMP4 regulate transitions of mesoderm to endothelium and blood cells in a human model of yolk sac hematopoiesis. Experimental Hematology. 103, 30-39 (2021).
  14. Julian, L., Olson, M. F. Rho-associated coiled-coil containing kinases (ROCK): Structure, regulation, and functions. Small GTPases. 5, 29846 (2014).
  15. Anitua, E., Prado, R. Addressing reproducibility in stem cell and PRP therapies. Trends in Biotechnology. 37 (4), 340-344 (2019).
  16. McMurtrey, R. J. Analytic models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).
  17. McKeown, S. R. Defining normoxia, physoxia and hypoxia in tumours-Implications for treatment response. The British Journal of Radiology. 87 (1035), 20130676 (2014).
  18. Thomlinson, R. H., Gray, L. H. The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy. British Journal of Cancer. 9 (4), 539-549 (1955).
  19. Olive, P. L., Vikse, C., Trotter, M. J. Measurement of oxygen diffusion distance in tumor cubes using a fluorescent hypoxia probe. International Journal of Radiation Oncology. 22 (3), 397-402 (1992).
  20. Torres Filho, I. P., Leunig, M., Yuan, F., Intaglietta, M., Jain, R. K. Noninvasive measurement of microvascular and interstitial oxygen profiles in a human tumor in SCID mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2081-2085 (1994).
  21. Lanzen, J., et al. Direct demonstration of instabilities in oxygen concentrations within the extravascular compartment of an experimental tumor. Cancer Research. 66 (4), 2219-2223 (2006).
  22. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3 (2), 1565 (2008).
  23. Sun, X. Y., et al. generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. eLife. 11, 76707 (2022).

Tags

Blood Vessel OrganoidsPluripotent Stem CellsVasculogenesisAngiogenesisVascular DiseaseVascular PathologiesReproducibilityHigh ThroughputStem Cell LinesDiabetic VasculopathyAggregatesCell DissociationAggregation MediumSingle-cell SuspensionCell ViabilityMesoderm Media

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Werschler, N., Penninger, J. Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (191), e64715, doi:10.3791/64715 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image