פרוטוקול זה מתאר את היצירה של כלי דם המארגנים את עצמם מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ומושרים פלוריפוטנטים. רשתות כלי דם אלה מציגות רשת אנדותל נרחבת ומחוברת המוקפת בפריציטים, אקטין שריר חלק וקרום מרתף רציף.
אורגנואיד מוגדר כרקמה רב-תאית מהונדסת במבחנה המחקה את האיבר המקביל לה in vivo כך שניתן להשתמש בו כדי לחקור היבטים מוגדרים של אותו איבר בצלחת תרבית רקמה. הרוחב והיישום של מחקר אורגנואידים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) התקדמו באופן משמעותי וכוללים את המוח, הרשתית, צינור הדמעות, הלב, הריאות, המעי, הלבלב, הכליות וכלי הדם, בין מספר רקמות אחרות. פיתוח שיטות ליצירת כלי דם אנושיים, במיוחד, פתח את הדרך למידול התפתחות כלי דם אנושיים ומחלות במבחנה ולבדיקה וניתוח של תרופות חדשות או טרופיזם רקמות בזיהומים וירוסים, כולל SARS-CoV-2. פרוטוקולים מורכבים וממושכים ללא הנחיה חזותית מעכבים את יכולת השחזור של אורגנואידים רבים שמקורם בתאי גזע. בנוסף, הסטוכסטיות האינהרנטית של תהליכי היווצרות אורגנואידים וארגון עצמי מחייבת יצירת פרוטוקולים אופטיים כדי לקדם את ההבנה של רכישה ותכנות של גורל התא. כאן, פרוטוקול מונחה חזותית מוצג עבור הדור של אורגנואידים תלת-ממדיים של כלי דם אנושיים (BVOs) שהונדסו מ-hPSCs. BVOs מציגים קרום מרתף רציף, תאי אנדותל וסקולריים וארטיקולציה מאורגנת עם תאי קיר, ומציגים את התכונות הפונקציונליות, המורפולוגיות והמולקולריות של כלי הדם הזעירים האנושיים. היווצרות BVO מתחילה באמצעות היווצרות מצטברת, ואחריה מזודרם ואינדוקציה וסקולרית. הבשלת כלי הדם והיווצרות הרשת יזומות ונתמכות על ידי הטמעת אגרגטים בקולגן תלת-ממדי ובמטריצת קרום מרתף מסיסה. רשתות כלי שיט אנושיים נוצרות תוך 2-3 שבועות וניתן להגדיל אותן עוד יותר במערכות תרבית מדרגיות. חשוב לציין, BVOs מושתלים בעכברים מדוכאי חיסון אנסטומוזים עם זרימת עכבר אנדוגנית ומציינים לעורקים פונקציונליים, ורידים ועורקים. הפרוטוקול הנוכחי מונחה חזותית יקדם את מחקר האורגנואידים בבני אדם, במיוחד ביחס לכלי דם בהתפתחות תקינה, כלי דם של רקמות ומחלות.
תפקוד לקוי של כלי הדם ומחלות כלי דם נוכחים עם סיבוכים ניכרים בתפקודי איברים. מחלות לב וכלי דם (CVD) הן סיבת המוות המובילה בעולם1 והיא גם הגורם העיקרי לעלייה בעלויות הבריאות בארצות הברית. מספרי מקרי CVD גדלים מדי שנה, ומספר עולה של מקרים אלה מתרחש בקבוצות גיל צעירות יותר (20-45 שנים)2. מודלים מרובים in vivo פותחו כדי לחקור את ההתפתחות וההבשלה של כלי דם, מחלות כלי דם ותפקוד לקוי של האנדותל 3,4. כיום, שיטות המשלבות תאים בודדים ומרובים המוגדרים על ידי שושלת שמקורם בתאי גזע או שבודדו מרקמות בוגרות in vivo יכולות ליצור רשתות כלי דם המשכפלות היבטים של תפקוד כלי הדם האנושיים והאנטומיה 5,6. כלי הדם התפתחו כאחת המערכות התפקודיות הראשונות במהלך ההתפתחות מהמזודרם, והם מתארגנים באמצעות תהליך הרכבה הנקרא “וסקולוגנזה” או על ידי התרחבות והסתעפות מכלי דם קיימים, המכונה “אנגיוגנזה”7.
תוך מינוף כוחה של ביולוגיה התפתחותית והרכבה מכוונת עצמית, וימר ועמיתיו דיווחו על אורגנואידים תלת-ממדיים ראשונים של כלי דם אנושיים בעלי ארגון עצמי מתאי גזע גזעיים (hPSC), המציגים את המאפיינים הפונקציונליים, המורפולוגיים והמולקולריים של כלי הדם הזעירים האנושיים8. בדומה לכלי הדם האנושיים9, hBVOs אלה נוצרים ונוכחים עם אנדותל, קרום מרתף רציף, ותאי ציור קיר סביבו 8,10. hBVOs ניתן להשתיל in vivo ו anastomosed עם מחזור הדם אנדוגני. הם יכולים גם לעבור התבגרות במבחנה ולשמש מודלים למחלות לב וכלי דם (כלומר, סוכרת)8 או טרופיזם רקמות בזיהומים וירוסים כגון SARS-CoV-211. בעוד שפרסמנו בעבר פרוטוקול כתוב10, לא קיים פרוטוקול וידאו זמין עבור טכניקה מורכבת זו.
באמצעות התקדמות הדרגתית תמציתית, היווצרות hBVO מושגת באמצעות היווצרות אגרגטים, השראת מזודרם באמצעות אגוניסט WNT, כירון (CHIR99021), וחלבון מורפוגני עצם – 4 (BMP4)12,13, השראת כלי דם באמצעות גורם גדילה אנדותל כלי דם A (VEGFA) ופורסקולין (Fors)12, והטבעה במטריצת הנבטה מותאמת אישית 8,10. התבגרות כלי הדם והיווצרות הרשת עוקבות אחר הטבעה של האגרגטים במטריצת הנבט. רשתות כלי דם אנושיים אלה נוצרות תוך 2-3 שבועות וניתן להסיר אותן ממטריצת ההנבטה ולגדול עוד יותר במערכות תרבית ניתנות להרחבה למשך עד 6 חודשים. כאן, נהלים מונחים אופטית מסופקים להיווצרות ויישום של כלי דם נגזר תאי גזע אנושיים.
פריצות דרך אחרונות בתרביות אורגנואידים שמקורם בתאי גזע סיפקו את המסגרת למודלים מתקדמים יותר ורלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית של כלי הדם האנושיים. מודל אורגנואיד כלי הדם האנושי (hBVO) המוצג כאן, שפותח במעבדהשלנו 8,10, מספק אמצעי רב עוצמה לחקור לא רק היבטים נוספים של כלי הדם האנושיים, אלא גם דרכים חדשות של מודלים של מחלות וטיפול רגנרטיבי 8,10,11. מודלים מרובים in vivo שימשו כדי לחקור את ההתפתחות וההבשלה של כלי דם, מחלות כלי דם ותפקוד לקוי של האנדותל 3,4. גישות שונות משלבות תאים בודדים ומרובים המוגדרים על ידי שושלת שמקורם בתאי גזע או מבודדים מרקמות בוגרות in vivo כדי ליצור רשתות כלי דם אנושיות משוכפלות 5,6. הפרוטוקול המוצג כאן ממנף את עקרון הביולוגיה ההתפתחותית והארגון העצמי כדי להניב את השושלת הרב-תאית הראשונה אי פעם של רשתות כלי דם אנושיות שניתן ליצור, למעשה, מ-hPSC 8,10 יחיד.
לכל קו תאי גזע יש מטען גנטי ייחודי והוא שונה מאחרים מבחינת המקור שלו, תפקודו והיענותו15. לכן, הפרוטוקול עבור אורגנואידים של כלי דם אנושיים (hBVOs) פותח ועבר אופטימיזציה כדי להבטיח תאימות פרוטוקול חזקה וניתנת לשחזור עם מספר (>12) קווי hPSC שונים 8,10. השיטה המתוארת כאן מייצרת אורגנואידים של כלי דם שמקורם ב-hPSC במשך שבועיים. עם זאת, שינויים בהרכב המדיה או בטכניקות ביצירת hBVO עלולים להוביל ליצירת רשת כלי דם ואורגנואידים לא יעילה. שיעורי ההתרבות המשתנים של קווי תאי גזע בודדים משפיעים במידה ניכרת גם על יכולת הרבייה של ניסויים בתאי גזע15, ולכן תרביות אורגנואידים. לדוגמה, ביצירת BVOs, תאים מתרבים יותר או מספרים גבוהים יותר של אגרגטים גדולים של יום 1 כפופים מטבעם לסביבות מטבוליות שונות ולפרמטרים שונים של דיפוזיה של גז וחומרים מזינים. זה, בתורו, משנה את זמני החשיפה לגורם הצמיחה ואת היעילות, את מידת ההתמיינות ואת הפריימינג של כלי הדם, והכי חשוב, את היכולת ליצור רשתות כלי דם עם הטמעת האגרגטים בקולגן 1 ובמטריצת קרום המרתף המסיס.
הדיפוזיה הפסיבית של חמצן וניהול חומרים מזינים חיוניים מסביבה חיצונית אינה אידיאלית לצמיחת תאים לטווח ארוך של אורגנואידים תלת-ממדיים ומורפוגנזה של רקמות במבחנה16. למרות שהדבר תלוי במספר גורמים (כלומר, קצב חילוף החומרים של הרקמות, הזמינות הביולוגית של חומרי המזון והגזים, סביבה סטטית או דינמית), נקבעה מגבלת דיפוזיה כללית של 150 מיקרומטר O2 וחומרים מזינים עבור רקמות בתרבית במבחנה, בהתחשב בכך שמבחינה פיזיולוגית, רקמות אנושיות מציגות חבלים של תאים חיים בטווח של 150 מיקרומטר מכלי דם מחוררים17. למרות שמרחקי דיפוזיה יעילים של גז וחומרים מזינים של 70-200 מיקרומטר הוצעו גם 18,19,20,21, צפיפות המבנה, הטמפרטורה, ה- pH והרכב המדיה משפיעים באופן משמעותי על יעילות הדיפוזיה. הודות לאופטימיזציה של שטח הפנים ותקשורת קולטני אינטגרין-בטא לאחר יום 6 הטבעה, אגרגטים בקוטר 250-300 מיקרומטר מתפקדים טוב יותר מאלו בקוטר >500-600 מיקרומטר, וכתוצאה מכך תהליך הנבטת כלי דם שלם וליבת אורגנואיד מעובה מינימלית. לפיכך, גודל הצבירה הוא קריטי ויכול להיות מושפע הן ממספר התאים המשמשים במהלך הזריעה הראשונית והן מהזמן המוקצב להיווצרות הצבירה. לוחות מיקרווול המאפשרים שליטה על גודל הצבר והמספר22 הם חלופה בת קיימא לטכניקת היווצרות האגרגטים הסטוכסטית הנובעת משימוש בלוחות חיבור 6 בארות נמוכים במיוחד בפרוטוקול זה. עקביות בתזמון ובניהול הגדלים המצטברים במהלך 6 הימים הראשונים של פרוטוקול hBVO היא אחד האינדיקטורים המכריעים, אם לא החשוב ביותר, לפיתוח מוצלח של אורגנואידים של כלי דם בתום לב.
יש להשלים שינויים בינוניים ביום 1 (השראת מזודרם) וביום 4 (השראת כלי דם) בשילוב עם שיקוע האגרגטים. למרות שצנטריפוגה היא חלופה מפתה, הכוחות הנוספים המופעלים על האגרטים החלשים עלולים לגרום לגושים, הרכבה וגזירה לא רצויים, המשפיעים לרעה על הדיפרנציאציה, ההתבגרות ויעילות ההנבטה בשלבים מאוחרים יותר של הפרוטוקול. עבודה על קרח במהלך היום 6 תהליך הטבעה הוא קריטי לשמירה על פילמור ECM תקין והיווצרות שכבות. במהלך השראת ההטבעה וההנבטה של האגרגטים, חשיפת ה-ECM לטמפרטורות מעל 4°C ו/או ECM pH שאינו 7.4 תשפיע לא רק על שיעורי הפילמור ושלמות שכבת ה-ECM אלא גם על יעילות ההנבטה של האגרגטים המשובצים. האופי האלסטי של מטריצת הנבטת ECM מאפשר ניתוק והובלה קלים מצלחת התרבית בת 12 הקידוחים למשטח החיתוך הסטרילי. אורגנואידים בודדים שהוסרו מהמטריצה והועברו ללוחות 96 בארות חיבור נמוכים במיוחד יצרכו את שארית ה- ECM שמסביב וישמרו על רשתות מיקרו-כלי אנדותל מצופים תאי קיר מאורגנים עם קרום מרתף רציף.
אמנם לא מכוסה בהצעה זו, שינויים בהרכבי התקשורת יכולים לשכפל מחלות אשר, בתורו, לעורר תגובות פתולוגיות hBVOs 8,11. גבולות מידול מחלות באמצעות מערכת hBVO רחוקים מלהיות ידועים, וזה בהחלט תחום שצריך לחקור. היישום של טכנולוגיית אורגנואיד כלי הדם שלנו בכלי הדם של מבנים אורגנואידים אווסקולריים בעבר23 הוא גם בעל השפעה ועניין משמעותיים.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לכל חברי המעבדות שלנו על הקלט והדיונים הקריטיים. JMP קיבל מימון מקרן T. von Zastrow, פרס FWF Wittgenstein (Z 271-B19), האקדמיה האוסטרית למדעים, Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking (JU) תחת הסכם מענק מס ‘101005026, Leducq Transatlantic Networks of Excellence of Excellence in Cardiovascular Research, Allen Institute Distinguished Investigator Program ותוכנית 150 קתדרות המחקר של קנדה F18-01336 וכן מענקי COVID-19 של המכונים הקנדיים לחקר הבריאות F20-02343 ו- F20-02015.
1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
2-Mercaptoethanol | Millipore | 60-24-2 | |
7.5% sodium bicarbonate | Gibco | 5080094 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | cell dissociation reagent |
Albumin fraction V (BSA) | AppliChem | A1391, 0100 | |
Alexa Fluor 488–anti-rabbit IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 711-546-152 |
Alexa Fluor 488–anti-sheep IgG | — | Life Technologies | A11015 |
Alexa Fluor 647–anti-goat IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 705-606-147 |
Automated cell counter | Invitrogen | Countess II | |
B27 supplement | Gibco | 12587010 | |
Biological safety cabinet | Faster | SafeFAST Premium 212 | |
BMP4 | Miltenyi BioTec | 130-111-165 | |
CD31 | Endothelial cell | DAKO | M0823 |
CD31 | Endothelial cell | R&D | AF806 |
Cellulose wipes | |||
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 4 KR | |
CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
Clear nail polish (essence, the gel, 01 absolute pure) | |||
CO2 incubator | New Brunswick | Galaxy 170S | |
Collagen type IV | Basement membrane | Millipore | AB769 |
Confocal microscope (10x, 20x, 63x objectives) | Leica | SP8 | |
Counting chamber slides- including 0.1% Trypan blue | Invitrogen | C10283 | |
Coverslips (22 x 50 mm) | |||
Cy3–anti-mouse IgG (Fab′)2 fragment | — | Jackson Immuno Research | 715-166-150 |
DAPI | Sigma | D9542 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
Dulbecco's Modefied Eagle's Medium (DMEM) | Sigma | D5648-10L | |
Eppendorf tubes | |||
Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Fetal Bovien Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
FGF2 | Miltenyi BioTec | 130-093-841 | |
Fine forceps | FST | 11254-20 | |
Fisherbrand Superfrost Clipped Corner Slides | Fisher Scientific | 12-550-016 | |
Forskolin | Sigma | F3917 | |
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Fisher Scientific | A1413302 | |
Glutamax | Gibco | 35050061 | |
Ham's F12 | Gibco | 11765054 | |
Horizontal laminar flow station, if stereomicroscope cannot fit in BSC | Thermo Scientific | Heraguard | |
Inverted contrasting tissue culture microscope | Zeiss | Vert.A1 | |
iSpacer | SunJinLab | IS009 | |
KnockOut DMEM/F12 | Gibco | 12660012 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
non-essential amino acids (NEAAs) | Gibco | 11140035 | |
Orbital shaker | |||
Parafilm | |||
Paraformaldehyde (4%) in PBS | Boston BioProducts | BM-155 | |
PDGFR-β | Pericyte | R&D | AF385 |
PDGFR-β | Pericyte | Cell Signaling | 3169S |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
pH indicator strips (6.5-10) | Mquant, Millipore | 109543 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Pipettes (P1000, P200 and P20) | Gilson, Integra Pipetboy | ||
Prime Surface-U 96-well plates | Sumilon | MS9096-U | |
PurCol | Advanced BioMatrix | 5005 | |
RapiClear CS gel | SunJinLab | RCCS005 | |
RapiClear CS mounting solution | SunJinLab | RCCS002 | |
Serological pipettes (5, 10 and 25 mL) | Falcon | 357529, 357530, 357515 | |
SMA | vSMC/Pericyte | Sigma | 2547 |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
Sodium hydroxide solution (NaOH, 1.0 N) | Sigma | S2770 | |
Solubilized Basement Membrane Matrix (i.e., Matrigel) | Corning | 356231 | |
Stainless steel micro spatula (rounded end) | Fisher Scientific | 21-401-5 | |
Stainless steel spoon (double-ended) | Fisher Scientific | BelArt H367290018 | |
Stemflex medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell culture medium |
StemPro-34 SFM | Gibco | 10639011 | flexible serum-free medium |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Sterile filter pipette tips (1,000, 300 and 20 μL) | Biozym, Surphob | VT0270, VT0250, VT0220 | |
Tissue culture–treated 12-well plates TC | BD Falcon | 353043 | |
Tissue culture–treated 6-well plates | Eppendorf | 30720113 | |
Triton X-100 | Sigma | 93420 | |
Tryple Express Enzyme (1x), Phenol Red | Thermo Scientific | 12605010 | mammalian cell dissociating enzyme |
Tween 20 | Sigma | P7949 | |
Ultra-low-attachment 6-well plates | Corning | 3471 | |
VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
Water bath (37 °C) | Fisher Scientific | Isotemp 210 | |
Y-27632 | Calbiochem | 688000 |