多能性幹細胞からのヒト血管オルガノイドの作製

本明細書において行う全ての実験は、市販のH9ヒトiPSC株を用いた。一般的な市販および非市販のヒト多能性幹細胞株(すなわち、H9、NC8)も、このプロトコルを使用してヒト血管オルガノイドの生成に有効であることがテストされ、証明されています。詳細については、以前に公開されたレポート8,10を参照してください。 1. ヒト血管オルガノイド作製のための培地および試薬製剤 凝集媒体を準備します。40 mLのノックアウトDMEM / F12(ヒトESCおよびiPS細胞増殖用に最適化されたL-グルタミンまたはHEPESバッファーを含まない低浸透圧培地)、10 mLのノックアウト血清代替品(KOSR)、0.5 mLの200 mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチドを0.85%NaClに、0.5 mLの非必須アミノ酸(NEAA)、35 μLのベータメルカプトエタノール(BME、10 mLの滅菌PBSに100 μLの2-メルカプトエタノール)を混合します。 Y-27632(プロテインキナーゼ[ROCK]14 [10 mM]を含むRho関連コイルドコイルの細胞透過性および選択的阻害剤)( 材料表を参照)。 N2B27(N2およびB27補給基本培地)を準備します。25 mLのDMEM/F12、25 mLの神経基底培地、1 mLのB27サプリメント、0.5 mLのN2サプリメント、250 μLの200 mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチドを0.85%NaCl中、および35 μLのβ-メルカプトエタノールを混合します( 材料の表を参照)。 中胚葉誘導培地を調製する。N2B27培地にChiR(12 μM、中胚葉誘導を刺激するGSK3a/b阻害剤)およびBMP-4(30 ng/mL、中胚葉系譜を誘導するMSX2活性化因子)を補充します。注: ストック (ChiR): 10 mM (1:833 または 1.2 μL/mL N2B27 を使用)。ストック(BMP-4):100 μg/mL(1:3333または0.3 μL/mL N2B27を使用)( 材料表参照)。 血管誘導培地を調製する。N2B27培地にVEGFA(100 ng/mL)およびフォルスコリン(2 μM)を補充します( 材料表参照)。 細胞外マトリックス(ECM)を準備します。12ウェルプレートの1ウェルに1 mLのECMを使用します(30〜50個の凝集体を包埋するため)。各ウェルに使用した1 mLのECM溶液のうち、0.5 mLを使用してECMファンデーションとして機能する最下層「レイヤー1」を作成し、最上層「レイヤー2」に0.5 mLプラス凝集体を作成します。このアプローチを使用すると、ECMサスペンションを介して、人間の血管ネットワークがあらゆる方向に発芽するのに十分なスペースとサポートが提供されます。注:全体として、1 mLのECMには、500 μLの精製ウシコラーゲンタイプI、250 μLのEngelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫細胞によって分泌される可溶化基底膜マトリックス( 材料の表を参照)、および250 μLの基本マトリックス溶液(ステップ1.5.2)が含まれています。新鮮に準備し、使用する準備ができるまで氷の上に保管してください。 4つの12ウェルプレート(48ウェル)用の基本マトリックス溶液を調製するには、5.627 mLの0.1 N NaOH、2.498 mLの10x DMEM、473 μLのHEPES、368 μLの7.5%重炭酸ナトリウム、233 μLの200 mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチドを0.85%NaCl中、および3.451 mLのHam’s F-12と混合します( 材料の表を参照)。注:残りの基本マトリックス溶液は、キャップ付きの50 mL高透明度ポリプロピレンコニカルチューブに入れ、4°Cで保存して最大2か月間使用できます。 発芽培地を準備します。具体的には、ヒト造血細胞の発生をサポートする50 mLのフレキシブル無血清培地(SFM)、1.3 mLの柔軟な無血清培地栄養補助食品、15%ウシ胎児血清(FBS)、250 μLのペニシリン-ストレプトマイシン、500 μLの200 mM L-アラニル-L-グルタミンジペプチドを0.85%NaCl、VEGFA(100 ng/mL)、およびFGF2(100 ng/mL)に配合します( 材料表を参照)。 ブロッキング バッファーを準備します。ウシ血清アルブミン0.5 g、ウシ胎児血清1.5 mL、トゥイーン20250 μL、Triton X-100 250 μL、デオキシコール酸ナトリウム500 μL(1%wt/volストック)、および47.5 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水を混合します( 材料の表を参照)。すべての成分が十分に組み込まれ、溶液が透明になるまで、上下にピペットで移動します。 2. ヒト多能性・人工多能性幹細胞の維持と培養 幹細胞培養培地でLDEVフリーの還元増殖因子基底膜マトリックス(1:50希釈)でコーティングされた6ウェル組織培養プレートを使用して細胞培養を行います( 材料表を参照)。 細胞が~70%コンフルエントに達したら、1 mLの哺乳類細胞解離酵素( 材料表を参照)を使用して37°Cで3〜4分間継代します。注:細胞を1:6の比率で分割すると、細胞の生存率が向上し、ほとんどのヒト幹細胞株で2〜4日以内にコンフルエントが達成されます。細胞生存率を高めるために、ROCK阻害剤Y-27632を添加した(10 mM、1:1,000)培養培地を継代後24時間使用します。 70%のコンフルエントに達するまで、培養液を毎日交換します。注:本研究では、70%コンフルエントで、6ウェル細胞培養プレートの1ウェルに約100万個のH9 hPSCが含まれています。 3. 0日目 – 単一細胞懸濁液からの多能性凝集体の生成 注:6ウェル培養プレートの2つのウェルで70%のコンフルエンシーを得ると、約175 hBVOが得られます。 ピペットまたは真空システムのいずれかを使用して、培養液を吸引し、1 mLの細胞解離試薬( 材料表を参照)と交換し、37°Cで5分間インキュベートします。 細胞が細胞解離試薬の下にある間に、6ウェル超低付着培養プレートで、必要な数のウェルに必要な量の凝集培地(ステップ1.1)を必要に応じて15 mLコニカルチューブに調製します( 材料表を参照)。 1 mLの細胞解離試薬を吸引し、細胞を1 mLの凝集培地に懸濁する。サンプルをカウントする前に、穏やかなアップダウンピペッティングで単一細胞懸濁液を作成します。注意:hPSCは機械的ストレスに非常に敏感であり、積極的なピペッティングには耐えられません。 顕微鏡下で自動細胞計数装置10 または標準化システムを用いて細胞を計数する。実験に必要な細胞数を計算します。注:細胞株によっては、200,000細胞/ウェルから300,000細胞/ウェルが凝集体形成に理想的であると考えられています(すなわち、4ウェル= 合計で800,000〜1,200,000細胞)。 適切な量の細胞懸濁液を、15 mLの高透明度ポリプロピレンコニカルチューブ内の凝集培地に加えます。希釈した細胞懸濁液を上下に静かにピペットで移動して、均一な細胞分布を確保します。 希釈した細胞懸濁液3 mLを6ウェル超低付着培養プレートの各所望のウェルにピペットで入れる。 プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2、湿度>90%)に入れ、インキュベーターのドアをできるだけ開閉させないでください。注意: この最初のステップは、夕方またはインキュベーターの交通量が少ないときに完了するのが最適です。わずかな振動でも骨材のサイズと形状に影響を与え、結果を損なう可能性があります。 4. 1日目 – 凝集体の中胚葉誘導 播種後24時間で、2〜10個の細胞を含む小さな凝集体が顕微鏡で見えるようにします。凝集体を収集し、培地を中胚葉誘導培地に変更する前にそれらを沈降させます(ステップ1.3)。 6ウェル超低接着培養プレートのウェルごとに15 mLの高透明度ポリプロピレンコニカルチューブを1本セットアップします。 円運動(すなわち、オービタルシェーカーのような)を使用して各ウェルの中央に凝集体を集め、1 mLピペットを使用して各ウェルから凝集体と周囲の培地を静かに収集し、対応する15 mLの高透明度ポリプロピレンコニカルチューブに入れ、凝集体を室温で沈降させます。 採取したら、この段階でほとんどの細胞株/凝集体が沈降するのに必要な時間である1時間のタイマーを設定します。注意: 時間が1時間未満の場合、15 mLの円錐管の底に沈降していない可能性のある凝集体が失われる可能性があります。 1時間が経過したら、注意して、ピペットまたは高感度吸引ポンプで上清を吸引します。15 mLコニカルチューブの底に凝集体が乱されていないことを確認してください。 各15 mLコニカルチューブの凝集体を2 mLの中胚葉誘導培地に再懸濁し、6ウェル超低付着培養プレートのそれぞれのウェルに戻します。 プレートをインキュベーター(37°C)に戻し、4日目まで放置します。注:凝集体が付着して互いに成長する場合は、1 mLピペットを使用して、凝集体の各ウェルを1日1回上下にゆっくりとピペットで移動させ、凝集体のサイズを同じに保ちます。 5.4日目-血管誘導と凝集体のプライミング 凝集体を収集し、培地を血管誘導培地に交換する前にそれらを沈降させます(ステップ1.4)。 6ウェル超低付着培養プレートのウェルごとに15 mLコニカルチューブを1本設置します。 円運動(すなわち、オービタルシェーカーのような)を使用して各ウェルの中央に凝集体を集め、1 mLピペットを使用して各ウェルから凝集体と周囲の培地を静かに収集し、対応する15 mLの円錐管に入れます。 収集したら、タイマーを30分に設定して、骨材を沈降させます。注:この段階では、ほとんどの細胞株で30分の時間が必要です。時間が30分未満の場合、15 mLコニカルチューブの底に沈降していない可能性のある凝集体を失うリスクがあります。 30分後、注意して、ピペットまたは高感度吸引ポンプで上清を吸引します。15 mLコニカルチューブの底に凝集体が乱されていないことを確認してください。 各15 mLコニカルチューブの凝集体を2 mLの血管誘導培地に再懸濁し、6ウェル超低付着培養プレートのそれぞれのウェルに戻します。 プレートをインキュベーター(37°C)に戻し、6日目まで放置します。注:1 mLピペットを使用して、凝集体の各ウェルを1日1回静かに上下にピペットで移動して、凝集体のサイズを同じに保ち、凝集体が互いに成長したり付着したりしないようにします。 6. 6日目 – 凝集包埋と血管芽誘導 氷上で作業しながら、ECMソリューションの目的の最終容量を準備します(ステップ1.5)。注:以下は、12ウェルプレート(30〜50個の凝集体)の1ウェルのプロトコルであり、必要に応じて調整できます。12ウェルプレートの1ウェルに対して、最下層として0.5 mLのECMを塗布し、最上層に0.5 mLのECMと凝集体を使用します。これにより、効果的な3D骨材の発芽に必要なECMの「サンドイッチ」が作成されます。 500 μLのECMを12ウェルプレートの1ウェルにピペットで入れます。気泡が形成されておらず、ウェル底部と側面のメニスカスが完全にコーティングされていることを確認してください。これは、ECMサンドイッチのレイヤー1を構成します。 プレートを37°Cで2時間戻します。注:効果的な重合には2時間の時間が必要です。時間が短いと、ECMの完全性が損なわれるリスクがあります。 レイヤー1重合の終わりに向かって、円運動を使用して各ウェルの中央に凝集体を集め、1 mLピペットを使用して各ウェルから凝集体と周囲の培地を静かに収集し、対応する15 mLコニカルチューブに入れます。 凝集体を10〜15分間沈降させ、上清を吸引します。 凝集体を氷上の15 mLコニカルチューブに5分間置きます。冷却しながら、重合層1が入った12ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。注意: 骨材を冷却すると、層2 ECMの早期重合を防ぐのに役立ちます。 気泡の形成を防ぐために迅速かつ慎重に作業し、凝集体を500 μLのECMに再懸濁し、すでに重合された層1の上にECM凝集体懸濁液をピペットで移します。層1に触れないように注意し、200 μLのピペットチップを使用して、層2と凝集体をウェルの周りに静かに分散させます。 プレートを37°Cで2時間戻します。注:効果的なECM重合には、2時間のインキュベーション時間が必要です。時間が短いと、ECMの完全性が損なわれるリスクがあり、層1と層2の間の強力な接着が妨げられる可能性があります。 予め温めた(37°C)発芽培地1 mLを加えて(ステップ1.6)、血管分化を誘導します。発芽船は、埋め込み後1日から3日後に出現する必要があります。3日後に培地を交換し、その後1日おきに培地を交換してください。注意: 発芽培地は事前に温めておく必要があります。そうしないと、レイヤーのデタッチが発生し、ECMの整合性が影響を受ける可能性があります。 7. 11日目 – BVOの分離と成熟 無菌条件下で作業する場合は、滅菌スパチュラの丸みを帯びた端を使用して、血管網を含むECM発芽マトリックスを緩めます。この段階では、ゲルはフリーフローティングディスクに似ていなければなりません。滅菌鉗子と滅菌ヘラの丸い端を使用して、ゲルディスク(血管網を含む)を10 cmの培養皿の蓋に慎重に移します。 所望の倍率および焦点に調整された実体顕微鏡の下に蓋とゲルを置き、滅菌針を使用して単一の血管網を切り取り、プロセスで得られる非血管新生ECMの量を制限しようとします。注:細胞は時間の経過とともに周囲のECMを自然に分解します。ただし、各オルガノイドで切り出す量を減らすと、画質と自立型容器ネットワークの完全性が向上します。 すべてのオルガノイドがゲルから単離されたら、3 mLの発芽培地を入れた超低接着6ウェルプレートの1ウェルに静かに戻します。この段階で、オルガノイドを一晩放置することも、すぐにステップ7.4に進むこともできます。 1 mLピペットを使用して、単一のオルガノイドを6ウェルプレートから超低アタッチメント96ウェルプレートのウェルに移します。移管後、予め温めた(37°C)発芽培地200 μLを96ウェルプレートの各ウェルに加えます。注:12ウェルプレートからの血管オルガノイドの1ウェルは、96ウェルプレートの30〜40ウェルを満たす必要があります。 96ウェルプレートでの単離後4〜6日で、オルガノイドが丸くて健康な形態を持っていることを確認します。この段階で、オルガノイドを固定し、染色の準備が整います。 8. 15日目 – BVOの固定、ブロッキング、染色 カットした1 mLチップを使用して、オルガノイドを1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。 BVOの吸引を避けるように注意しながら、200 μLまたは1,000 μLのピペットを使用してマイクロ遠心チューブ内の残りの発芽培地を除去し、PBSに1 mLの4%PFAを1時間加えます。注意: 室温でオービタルシェーカー(125 rpm)に固定することをお勧めします。最大60BVO /マイクロ遠心チューブが許容されます。これ以上のBVOは、固定と洗浄の有効性を損ないます。注意: PFAは有害な化学物質です。ドラフト内では注意して使用し、使用方法および適切な廃棄方法については、製造元の指示に従ってください。 新しく固定したBVOを3%PBS-トゥイーンで毎回15分間0.25回洗浄します。 オルガノイドの直径が1 mmを超える場合は、PBS中の1%Triton X-100で室温で30〜60分間BVOを透過処理します。 0.25% PBS-Tweenをすべて吸引し、1 mLのブロッキングバッファーを加えます(ステップ1.7)。注:抗体に依存しますが、オービタルシェーカー(125 rpm)で室温で2時間、染色プロセス中の非特異的抗体結合を減らすのに十分です。オルガノイドは、4°Cのブロッキングバッファーに最大2週間放置できます。 ブロッキングバッファーを除去し、1 mLのブロッキングバッファーで希釈した一次抗体(1:100)を追加します。オービタルシェーカー(12 rpm)で4°Cで一晩保持し、オルガノイドが一次抗体溶液に沈めたままであることを確認します。注:一次抗体の一晩のインキュベーションは、この研究に使用された抗体に適しています。必要な一次抗体と二次抗体、およびそれぞれの希釈液は 、材料表に記載されています。 一次抗体を一晩インキュベートした後、一次抗体溶液を除去し、0.25%PBS-Tweenで毎回3回15分間洗浄します。 1 mLのブロッキングバッファーで希釈した二次抗体(1:250)とDAPI(1:1,000)を加え、室温または4°Cで一晩2時間インキュベートします。注:サンプルが正しく調製されている場合(上記のように)、室温または4°Cで一晩2時間のインキュベーションが本研究で使用される抗体に適しています。 インキュベーション後、二次抗体溶液を除去し、0.25% PBS-Tweenで毎回3回15分間洗浄します。注:染色後、オルガノイドはPBSで最大2週間保持できます。 9. 血管オルガノイド(BVO)の装着 取り付けスペーサーを目的のイメージングカバースリップに接着します( 材料表を参照)。 カットした1 mmピペットチップを使用し、1 mLピペットを使用して単一のオルガノイドをスペーサーウェルに移し、残りのPBSを吸引します。 75°Cに加熱した150〜200μLの透明溶液( 材料表を参照)をウェルに満たし、オルガノイドを完全に沈めます。注意: サンプルは、温めた透明溶液にさらされてから1時間以内に透明になるはずです。1時間の透明化時間が不十分な場合は、オルガノイドを室温で6時間から一晩、暗所の蓋付き箱に入れて透明になるように放置します。.サンプルを一晩放置する場合は、乾燥しないように十分な透明溶液があることを確認してください。 透明化後、100〜200μLのピペットチップで透明化溶液を注意深く吸引します。オルガノイドをスペーサーウェルの中心まで静かに操作し、ウェルがいっぱいになるまで、取り付けゲル( 材料表を参照)の滴を追加します(制御された加熱ブロックで75°Cに温めます)。 2番目のカバースリップを取り付けスペーサーの上にそっと置き、下部カバースリップと上部カバースリップの間のスペースにサンプルを密封します。マウンティングゲルを暗所で4°Cで一晩硬化させます。注:硬化後、トップコートマニキュアを使用して、マウントされたサンプルをさらにシールできます。