Zebra balıklarında germline düzenlemelerinin hızlı izolasyonu için sperm taraması
Summary
CRISPR-Cas teknolojileri, genom düzenleme alanında devrim yarattı. Bununla birlikte, istenen germline düzenlemesini bulmak ve izole etmek büyük bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, bu protokol, standart PCR, kısıtlama sindirimi ve jel elektroforezi tekniklerini kullanarak germline düzenlemeleri için F0 CRISPR enjekte edilen zebra balığı spermini hızlı bir şekilde taramak için sağlam bir yöntem açıklamaktadır.
Abstract
Hedeflenen CRISPR-Cas nükleaz teknolojilerinin ortaya çıkışı, hem yerleşik hem de gelişmekte olan model sistemlerinde hassas genom düzenlemesi gerçekleştirme yeteneğinde devrim yarattı. CRISPR-Cas genom düzenleme sistemleri, CRISPR ile ilişkili (Cas) bir endonükleazı Cas endonükleazının çift iplikli bir kırılma oluşturduğu spesifik genomik DNA lokuslarına hedeflemek için sentetik bir kılavuz RNA (sgRNA) kullanır. Çift iplikçik kopmalarının içsel hataya eğilimli mekanizmalarla onarılması, lokusu bozarak yerleştirmelere ve / veya silmelere yol açar. Alternatif olarak, çift sarmallı DNA donörlerinin veya tek sarmallı DNA oligonükleotidlerinin bu sürece dahil edilmesi, tek nükleotid polimorfizmlerinden küçük immünolojik etiketlere ve hatta büyük floresan protein yapılarına kadar değişen hassas genom düzenlemelerinin dahil edilmesini sağlayabilir. Bununla birlikte, bu prosedürdeki büyük bir darboğaz, germ hattında istenen düzenlemeyi bulmak ve izole etmek olabilir. Bu protokol, Danio rerio’daki (zebra balığı) spesifik lokuslarda germline mutasyonlarını taramak ve izole etmek için sağlam bir yöntem ortaya koymaktadır; Bununla birlikte, bu prensipler in vivo sperm toplanmasının mümkün olduğu herhangi bir modele uyarlanabilir.
Introduction
CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas sistemi, Danio rerio (zebra balığı) model sistemi 1,2,3,4’te lokuslara özgü mutajenez ve hassas genom düzenlemesi gerçekleştirmek için güçlü bir araçtır. Cas-ribonükleoprotein (RNP) iki ana bileşenden oluşur: bir Cas endonükleaz (genellikle Cas9 veya Cas12a) ve bir lokusa özgü sentetik kılavuz RNA (sgRNA)5. Birlikte, Cas-RNP, istenen lokusta, iki içsel onarım mekanizmasından biri tarafından onarılabilen çift sarmallı bir kırılma (DSB) üretir. Homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) onarım mekanizması hataya eğilimlidir ve genellikle DSB çevresinde çeşitli eklemeler veya silmeler (indel) ile sonuçlanır. Bu indeller, ortaya çıkan protein dizisinde bir çerçeve kayması mutasyonu veya erken durma meydana getirirlerse zararlı olabilirler. Alternatif olarak, homolojiye yönelik onarım (HDR) mekanizması, hasarı onarmak için DSB bölgesini çevreleyen homoloji bölgelerini içeren bir donör şablonu kullanır. Araştırmacılar, hassas genomik düzenlemeler oluşturmak için HDR sisteminden yararlanabilirler. Spesifik olarak, istenen düzenlemeleri ve genomdaki DSB bölgesini çevreleyen homoloji bölgelerini içeren çift sarmallı bir DNA donör yapısını birlikte enjekte edebilirler. Ticari olarak üretilen bu CRISPR bileşenleri için artan ölçek ekonomisi, çoklu lokusların taranmasının ve hassas genom düzenlemesi için daha büyük ölçekli çabaların oluşturulmasının önündeki engelleri büyük ölçüde azaltmıştır. Bununla birlikte, cinsel olarak üreyen hayvan modellerinde, büyük bir darboğaz, germline stabil mutant hayvanların tanımlanması ve izolasyonudur.
Zebra balığı model sistemi, ters genetik çalışmalarda kullanımını artıran birkaç temel nitelik sergilemektedir. Temel su barınağı ekipmanı ile çok sayıda arkaya çekilmeleri kolaydır ve dişiler tüm yıl boyunca6 boyunca yüksek doğurganlık sergilerler. Dahası, dış yumurtlama ve döllenme onları CRISPR / Cas bileşenlerinin mikroenjeksiyonuna uygun hale getirir. Cas-RNP, teoride tüm yavru hücreler tarafından miras alınan DSB’ler / onarımlar üretmek için genellikle tek hücreli aşamalı zebra balığı embriyolarına enjekte edilir. Bununla birlikte, diploid genomlar, her iki homolog kromozomu da mutajenize etmek için iki DSB / onarım olayı gerektirir. Ayrıca, Cas-RNP tek hücreli aşamada enjekte edilmesine rağmen, DSB / onarım, gelişimin sonraki noktalarına kadar gerçekleşmeyebilir. Birlikte, bu faktörler F0 enjekte edilen balıkların mozaik doğasına katkıda bulunur. Yaygın bir uygulama, F0 enjekte edilen balıkları geçmek ve F1 soyunu indeller / spesifik düzenlemeler için taramaktır. Bununla birlikte, F0 enjekte edilen tüm balıklar germline mutasyonlarına sahip olmadığından, bu uygulama istenen düzenlemeyi üretmeyen birçok verimsiz haçla sonuçlanır. F1 somatik doku yerine F0 germline taraması, istenen germline düzenlemesini izole etme olasılığını arttırır ve bu süreçte gerekli olan hayvan sayısını azaltır.
F0 enjekte edilen zebra balıklarından ötenaziye gerek kalmadan kolayca sperm toplanabilir. Bu özellik, dondurulmuş sperm stoklarının kriyoprezervasyonuna ve yeniden türetilmesine izin verir7, ancak istenen genomik mutasyonların germline taşıyıcılarını hızlı bir şekilde taramak, tanımlamak ve izole etmek için de kullanılabilir 8,9. Brocal ve ark. (2016) daha önce F0 enjekte edilen erkek zebra balığı10’da germline düzenlemelerini taramak için dizileme tabanlı bir yöntem tanımlamıştır. Germ hattında bulunan mutasyona uğramış alelleri tanımlamak için yararlı olsa da, bu yaklaşım yüksek verimde maliyetli olabilir ve tüm laboratuvarlar için erişilebilir olmayabilir. Buna karşılık, mevcut protokol, germline düzenlemelerini tanımlamak için ulaşılabilir ve uygun maliyetli bir elektroforez tabanlı strateji sunmaktadır. Spesifik olarak, bu protokol, yüksek çözünürlüklü agaroz jel elektroforezi kullanarak spesifik lokuslarda germline mutasyonlarını taramak ve izole etmek için sağlam bir yöntemi özetlemektedir. Ek olarak, bu protokol, belirli düzenlemeleri içeren bir bağışçı yapısının başarılı entegrasyonunu tanımlamak için benzer bir stratejiyi açıklamaktadır. Her zaman olduğu gibi, belirli düzenlemeler isteniyorsa, sıralama tabanlı stratejiler aşağıda açıklanan protokolle birlikte gerçekleştirilebilir. Bu protokol zebra balığı model sistemine özgü olsa da, bu ilkeler sperm toplanmasının rutin bir prosedür olduğu herhangi bir modele uyarlanabilir olmalıdır. Birlikte, bu stratejiler, F0 enjekte edilen erkeklerin, standart polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve / veya kısıtlama sindiriminden sonra bir jel üzerinde çözülebilen germline indelleri / düzenlemeleri ile tanımlanmasına izin verecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, F0 erkek sperm genomlarına odaklanmış analiz yoluyla CRISPR-Cas teknolojisini kullanarak varsayılan genom düzenlemelerini veya hedeflenen mutasyonları hızlı bir şekilde karakterize etmek için bir yöntem açıklamaktadır. Bu protokol, spermin ötenazi olmadan örnekleme için hazır olduğu diğer hayvan modellerine uygun olmalıdır. Bu yöntem, istenen düzenlemeler için tarama verimini artırır ve özellikle nadir HDR aracılı zincirleme olayları tanımlamak için kullanışlıdır. Bu yakl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi’nden Anna Hindes’e, sıcak atış yöntemini kullanarak kaliteli sperm genomik DNA’sı elde etme konusundaki ilk çabaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü tarafından Ödül kapsamında finanse edilmiştir (R01AR072009 to R.S.G.).
Materials
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
|
| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
|
| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
|
| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
|
| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
|
| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
References
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Troutwine, B. R., et al. The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine. Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).
- Xu, Y., Li, Z. CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).
- Creaser, C. W. The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year. Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).
- Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).
- Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish. Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).
- Gray, R. S., et al. Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish. Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).
- Brocal, I., et al. Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish. BMC Genomics. 17, 259 (2016).
- Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619 (2022).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Hill, J. T., et al. Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Liu, Q., et al. Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems. Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
