Screening van sperma op de snelle isolatie van kiembaanbewerkingen bij zebravissen
Summary
CRISPR-Cas-technologieën hebben een revolutie teweeggebracht op het gebied van genoombewerking. Het vinden en isoleren van de gewenste kiembaanbewerking blijft echter een groot knelpunt. Daarom beschrijft dit protocol een robuuste methode voor het snel screenen van F0 CRISPR-geïnjecteerd zebravissperma op kiembaanbewerkingen met behulp van standaard PCR-, restrictieverterings- en gelelektroforesetechnieken.
Abstract
De komst van gerichte CRISPR-Cas-nucleasetechnologieën heeft een revolutie teweeggebracht in het vermogen om nauwkeurige genoombewerking uit te voeren in zowel gevestigde als opkomende modelsystemen. CRISPR-Cas genoombewerkingssystemen gebruiken een synthetisch gids-RNA (sgRNA) om een CRISPR-geassocieerde (Cas) endonuclease te richten op specifieke genomische DNA-loci, waar de Cas-endonuclease een dubbelstrengsbreuk genereert. Het herstel van dubbelstrengsbreuken door intrinsieke foutgevoelige mechanismen leidt tot inserties en/of deleties, waardoor de locus wordt verstoord. Als alternatief kan de opname van dubbelstrengs DNA-donoren of enkelstrengs DNA-oligonucleotiden in dit proces de opname van precieze genoombewerkingen uitlokken, variërend van enkelwandige nucleotidepolymorfismen tot kleine immunologische tags of zelfs grote fluorescerende eiwitconstructen. Een groot knelpunt in deze procedure kan echter het vinden en isoleren van de gewenste bewerking in de kiembaan zijn. Dit protocol schetst een robuuste methode voor het screenen en isoleren van kiembaanmutaties op specifieke loci in Danio rerio (zebravis); Deze principes kunnen echter worden aangepast in elk model waar in vivo spermaverzameling mogelijk is.
Introduction
Het CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas-systeem is een krachtig hulpmiddel om loci-specifieke mutagenese en nauwkeurige genoombewerking uit te voeren in het Danio rerio (zebravis) modelsysteem 1,2,3,4. Het Cas-ribonucleoproteïne (RNP) bestaat uit twee hoofdcomponenten: een Cas-endonuclease (gewoonlijk Cas9 of Cas12a) en een locusspecifiek synthetisch gids-RNA (sgRNA)5. Samen genereert de Cas-RNP een dubbelstrengsbreuk (DSB) in de gewenste locus die kan worden gerepareerd door een van de twee intrinsieke reparatiemechanismen. Het niet-homologe end joining (NHEJ) reparatiemechanisme is foutgevoelig en resulteert vaak in een verscheidenheid aan inserties of deleties (indels) rond de DSB. Deze indels kunnen schadelijk zijn als ze een frameshiftmutatie of voortijdige stop in de resulterende eiwitsequentie introduceren. Als alternatief gebruikt het homologie-gerichte reparatiemechanisme (HDR) een donorsjabloon met homologiegebieden rond de DSB-site om de schade te herstellen. Onderzoekers kunnen profiteren van het HDR-systeem om nauwkeurige genomische bewerkingen te genereren. In het bijzonder kunnen ze een dubbelstrengs DNA-donorconstruct co-injecteren dat de gewenste bewerkingen bevat, evenals homologiegebieden die de DSB-site in het genoom flankeren. De toegenomen schaalvoordelen voor deze commercieel geproduceerde CRISPR-componenten hebben de barrières voor het screenen van meerdere loci en voor het opzetten van grootschalige inspanningen voor nauwkeurige genoombewerking aanzienlijk verminderd. In seksueel reproducerende diermodellen is een belangrijk knelpunt echter de identificatie en isolatie van kiembaanstabiele mutante dieren.
Het zebravismodelsysteem vertoont verschillende sleutelkwaliteiten die het gebruik ervan in omgekeerde genetische studies verbeteren. Ze zijn gemakkelijk in grote aantallen groot te brengen met elementaire aquatische huisvestingsapparatuur en vrouwtjes vertonen het hele jaar door een hoge vruchtbaarheid6. Bovendien maken hun externe eileg en bevruchting ze vatbaar voor de micro-injectie van CRISPR / Cas-componenten. De Cas-RNP wordt gewoonlijk geïnjecteerd in eencellige zebravisembryo’s om DSB’s / reparatie te genereren die in theorie door alle dochtercellen worden geërfd. Dipeloïde genomen vereisen echter twee DSB/reparatiegebeurtenissen om beide homologe chromosomen te mutageneren. Bovendien, hoewel Cas-RNP wordt geïnjecteerd in het eencellige stadium, kan de DSB / reparatie pas op latere punten in de ontwikkeling plaatsvinden. Samen dragen deze factoren bij aan het mozaïekkarakter van F0-geïnjecteerde vissen. Een veel voorkomende praktijk is om F0-geïnjecteerde vissen te oversteken en het F1-nageslacht te screenen op indels / specifieke bewerkingen. Omdat echter niet alle F0-geïnjecteerde vissen kiembaanmutaties bezitten, resulteert deze praktijk in veel onproductieve kruisingen die niet de gewenste bewerking genereren. Het screenen van de F0-kiembaan in plaats van F1-somatisch weefsel verhoogt de kans op het isoleren van de gewenste kiembaanbewerking en vermindert het aantal dieren dat nodig is in dit proces.
Sperma kan gemakkelijk worden verzameld van F0-geïnjecteerde zebravissen zonder dat euthanasie nodig is. Deze functie maakt cryopreservatie en rederivatie van ingevroren spermavoorraden7 mogelijk, maar kan ook worden gebruikt om de kiembaandragers van gewenste genomische mutaties 8,9 snel te screenen, identificeren en isoleren. Brocal et al. (2016) beschreven eerder een op sequencing gebaseerde methode voor het screenen van kiembaanbewerkingen in F0-geïnjecteerde mannelijke zebravissen10. Hoewel nuttig voor het identificeren van de gemuteerde allelen in de kiembaan, kan deze aanpak kostbaar worden bij hoge doorvoer en is deze mogelijk niet voor alle laboratoria toegankelijk. Het huidige protocol biedt daarentegen een laagdrempelige en kosteneffectieve op elektroforese gebaseerde strategie voor het identificeren van kiembaanbewerkingen. Concreet schetst dit protocol een robuuste methode voor het screenen en isoleren van kiembaanmutaties bij specifieke loci met behulp van agarosegel-elektroforese met hoge resolutie. Daarnaast beschrijft dit protocol een vergelijkbare strategie voor het identificeren van de succesvolle integratie van een donorconstruct met specifieke bewerkingen. Zoals altijd, als specifieke bewerkingen gewenst zijn, kunnen op sequencing gebaseerde strategieën worden uitgevoerd in combinatie met het hieronder beschreven protocol. Hoewel dit protocol specifiek is voor het zebravismodelsysteem, moeten deze principes kunnen worden aangepast aan elk model waarin het verzamelen van sperma een routineprocedure is. Samen zullen deze strategieën de identificatie mogelijk maken van F0-geïnjecteerde mannetjes met kiembaan-indels / bewerkingen die kunnen worden opgelost op een gel na standaard polymerasekettingreactie (PCR) en / of restrictievertering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een methode voor het snel karakteriseren van vermeende genoombewerkingen of gerichte mutaties met behulp van CRISPR-Cas-technologie door gerichte analyse op F0 mannelijke spermagenomen. Dit protocol moet vatbaar zijn voor andere diermodellen waarbij sperma gemakkelijk beschikbaar is voor bemonstering zonder euthanasie. Deze methode verhoogt de doorvoer van screening voor gewenste bewerkingen en is vooral handig voor het identificeren van zeldzame HDR-gemedieerde knock-in-gebeurtenissen. Deze aanpa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Anna Hindes van de Washington University School of Medicine bedanken voor haar eerste inspanningen om sperma-genomisch DNA van goede kwaliteit te verkrijgen met behulp van de hot shot-methode. Dit werk werd gefinancierd door het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases van de National Institutes of Health under Award (R01AR072009 to R.S.G.).
Materials
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
|
| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
|
| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
|
| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
|
| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
|
| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
References
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Troutwine, B. R., et al. The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine. Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).
- Xu, Y., Li, Z. CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).
- Creaser, C. W. The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year. Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).
- Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).
- Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish. Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).
- Gray, R. S., et al. Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish. Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).
- Brocal, I., et al. Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish. BMC Genomics. 17, 259 (2016).
- Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619 (2022).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Hill, J. T., et al. Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Liu, Q., et al. Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems. Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
