Summary

Screening dello sperma per il rapido isolamento delle modifiche germinali nel pesce zebra

Published: February 10, 2023
doi:

Summary

Le tecnologie CRISPR-Cas hanno rivoluzionato il campo dell’editing del genoma. Tuttavia, trovare e isolare la modifica della linea germinale desiderata rimane un importante collo di bottiglia. Pertanto, questo protocollo descrive un metodo robusto per lo screening rapido dello sperma di zebrafish iniettato con F0 CRISPR per le modifiche della linea germinale utilizzando PCR standard, digestione di restrizione e tecniche di elettroforesi su gel.

Abstract

L’avvento delle tecnologie mirate di nucleasi CRISPR-Cas ha rivoluzionato la capacità di eseguire un accurato editing del genoma in sistemi modello sia consolidati che emergenti. I sistemi di editing del genoma CRISPR-Cas utilizzano un RNA guida sintetico (sgRNA) per indirizzare un’endonucleasi associata a CRISPR (Cas) a specifici loci del DNA genomico, dove l’endonucleasi Cas genera una rottura a doppio filamento. La riparazione delle rotture del doppio filamento mediante meccanismi intrinseci soggetti a errori porta a inserimenti e / o delezioni, interrompendo il locus. In alternativa, l’inclusione di donatori di DNA a doppio filamento o oligonucleotidi di DNA a singolo filamento in questo processo può suscitare l’inclusione di precise modifiche del genoma che vanno dai polimorfismi a singolo nucleotide a piccoli tag immunologici o persino grandi costrutti proteici fluorescenti. Tuttavia, un importante collo di bottiglia in questa procedura può essere trovare e isolare la modifica desiderata nella linea germinale. Questo protocollo delinea un metodo robusto per lo screening e l’isolamento delle mutazioni germinali in loci specifici in Danio rerio (zebrafish); Tuttavia, questi principi possono essere adattabili in qualsiasi modello in cui è possibile la raccolta di spermatozoi in vivo .

Introduction

Il sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas è un potente strumento per eseguire mutagenesi loci-specifica e editing preciso del genoma nel sistema modello Danio rerio (zebrafish) 1,2,3,4. La Cas-ribonucleoproteina (RNP) è composta da due componenti principali: un’endonucleasi Cas (comunemente Cas9 o Cas12a) e un RNA guida sintetico locus-specifico (sgRNA)5. Insieme, il Cas-RNP genera una rottura a doppio filamento (DSB) nel locus desiderato che può essere riparata da uno dei due meccanismi di riparazione intrinseca. Il meccanismo di riparazione della giunzione finale non omologa (NHEJ) è soggetto a errori e spesso si traduce in una varietà di inserzioni o delezioni (indel) attorno al DSB. Questi indels possono essere deleteri se introducono una mutazione frameshift o un arresto prematuro nella sequenza proteica risultante. In alternativa, il meccanismo di riparazione diretta dall’omologia (HDR) utilizza un modello di donatore con regioni di omologia che circondano il sito DSB per riparare il danno. I ricercatori possono sfruttare il sistema HDR per generare modifiche genomiche precise. In particolare, possono co-iniettare un costrutto di donatore di DNA a doppio filamento che contiene le modifiche desiderate e le regioni di omologia che fiancheggiano il sito DSB nel genoma. La maggiore economia di scala per questi componenti CRISPR prodotti commercialmente ha notevolmente ridotto le barriere allo screening di più loci e alla creazione di sforzi su larga scala per l’editing preciso del genoma. Tuttavia, nei modelli animali che si riproducono sessualmente, un importante collo di bottiglia è l’identificazione e l’isolamento di animali mutanti stabili alla linea germinale.

Il sistema modello zebrafish presenta diverse qualità chiave che ne migliorano l’uso negli studi genetici inversi. Sono facili da allevare in gran numero con attrezzature di base per l’alloggiamento acquatico e le femmine mostrano un’elevata fecondità tutto l’anno6. Inoltre, la loro deposizione esterna delle uova e la fertilizzazione li rendono suscettibili alla microiniezione di componenti CRISPR / Cas. Il Cas-RNP viene comunemente iniettato in embrioni di zebrafish a una cellula per generare DSB / riparazione che è, in teoria, ereditato da tutte le cellule figlie. Tuttavia, i genomi diploidi richiedono due eventi DSB/riparazione per mutagenizzare entrambi i cromosomi omologhi. Inoltre, sebbene Cas-RNP venga iniettato allo stadio di una cellula, il DSB / riparazione potrebbe non verificarsi fino a punti successivi nello sviluppo. Insieme, questi fattori contribuiscono alla natura a mosaico del pesce iniettato con F0. Una pratica comune è quella di incrociare i pesci iniettati con F0 e controllare la progenie F1 per indel/modifiche specifiche. Tuttavia, poiché non tutti i pesci iniettati con F0 possiedono mutazioni germinali, questa pratica si traduce in molti incroci improduttivi che non generano la modifica desiderata. Lo screening della linea germinale F0 piuttosto che del tessuto somatico F1 aumenta la probabilità di isolare la modifica germinale desiderata e riduce il numero di animali necessari in questo processo.

Lo sperma può essere facilmente raccolto dal pesce zebra iniettato con F0 senza bisogno di eutanasia. Questa caratteristica consente la crioconservazione e la riderivazione di scorte di spermatozoi congelati7 ma può anche essere sfruttata per vagliare, identificare e isolare rapidamente i portatori della linea germinale delle mutazioni genomiche desiderate 8,9. Brocal et al. (2016) hanno precedentemente descritto un metodo basato sul sequenziamento per lo screening delle modifiche della linea germinale nel pesce zebra maschio iniettato con F010. Sebbene utile per identificare gli alleli mutati presenti nella linea germinale, questo approccio può diventare costoso in termini di produttività elevata e potrebbe non essere accessibile a tutti i laboratori. Al contrario, il protocollo attuale offre una strategia basata sull’elettroforesi accessibile ed economica per identificare le modifiche della linea germinale. In particolare, questo protocollo delinea un metodo robusto per lo screening e l’isolamento delle mutazioni germinali in loci specifici utilizzando l’elettroforesi su gel di agarosio ad alta risoluzione. Inoltre, questo protocollo descrive una strategia simile per identificare l’integrazione riuscita di un costrutto donatore contenente modifiche specifiche. Come sempre, se si desiderano modifiche specifiche, le strategie basate sul sequenziamento possono essere eseguite in tandem con il protocollo descritto di seguito. Sebbene questo protocollo sia specifico per il sistema modello del pesce zebra, questi principi dovrebbero essere adattabili a qualsiasi modello in cui la raccolta di spermatozoi è una procedura di routine. Insieme, queste strategie consentiranno l’identificazione di maschi iniettati in F0 con indels/edits germinali che possono essere risolti su un gel dopo reazione a catena della polimerasi standard (PCR) e/o digestione di restrizione.

Protocol

Questo studio è stato condotto in linea con le linee guida della Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dall’Università del Texas presso il Comitato per la cura e l’uso degli animali di Austin (AUP-2021-00254). 1. Progettazione dello sgRNA per la mutagenesi di CRISPR Ottenere la sequenza di esoni contenente i loci mirati. Progettare un RNA guida sintetico (sgRNA) con un si…

Representative Results

Gli approcci sperimentali descritti in questo protocollo consentono la più rapida identificazione di modifiche del genoma o presunti alleli deleteri concentrandosi sull’analisi di migliaia di genomi derivati dalla raccolta di spermatozoi maschili iniettati in F0. La Figura 2 illustra come interpretare i risultati ottenuti utilizzando questo protocollo. Per generare mutazioni nel locus p2ry12, sono stati iniettati embrioni di zebrafish a una cellula con endonuclea…

Discussion

Questo protocollo descrive un metodo per caratterizzare rapidamente le modifiche putative del genoma o le mutazioni mirate utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas mediante analisi focalizzata sui genomi degli spermatozoi maschili F0. Questo protocollo dovrebbe essere suscettibile di altri modelli animali in cui lo sperma è prontamente disponibile per il campionamento senza eutanasia. Questo metodo aumenterà il throughput dello screening per le modifiche desiderate ed è particolarmente utile per identificare rari eventi k…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Anna Hindes della Washington University School of Medicine per i suoi sforzi iniziali nell’ottenere DNA genomico spermatico di buona qualità utilizzando il metodo hot shot. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases del National Institutes of Health under Award (R01AR072009 to R.S.G.).

Materials

Agarose powder  Fisher BioReagents BP1356-100
Breeding tanks Carolina Biological  161937
BstNI Restriction Enzyme NEB R0168S
Cas9 Endonuclease IDT 1081060
DNA Ladder, 100 bp  Thermo Scientific  FERSM0241
dnah10 donor construct   Sigma-Aldrich DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry.
Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC
TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT
GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC
AGTGATTACGTCACGC-3')
dnah10 forward primer  Sigma-Aldrich DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT
TTGGC-3')
dnah10 reverse primer  Sigma-Aldrich DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA
ATACAGC-3') 
dnah10 synthetic sgRNA  Synthego  Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'
Electrophoresis power supply Thermo Scientific  105ECA-115
Filter forceps Millipore XX6200006P
Fish (system) water Generic n/a
Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber)  Thermo Scientific  B2
Gel imaging light box  Azure Biosystems AZI200-01
Gel stain, 10000X  Invitrogen S33102
Glass bowl, 250 mL  Generic n/a
Isolation tanks, 0.8 L  Aquaneering ZT080
Microcap capillary tube with bulb, 20 µL  Drummond 1-000-0020/CA
Minicentrifuge Bio-Rad 12011919EDU
Micropipettes, various with appropriate tips Generic  n/a
Microwave  Generic  n/a
Nuclease free water Promega P119-C
Paper towels Generic n/a
PCR tubes, 0.2 mL Bioexpress T-3196-1
Plastic spoon, with drilled holes/slots  Generic n/a
KCl solution, 0.2 M RNAse Free Sigma-Aldrich P9333
p2ry12 forward primer  Sigma-Aldrich DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT
-3')
p2ry12 reverse primer Sigma-Aldrich DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT
-3') 
p2ry12 synthetic sgRNA  Synthego  Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'
Restriction Enzyme 10X Buffer NEB B6003SVIAL
NaOH solution, 50 mM  Thermo Scientific  S318; 424330010
Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot Generic  n/a
Stereomicroscope Zeiss Stemi 508
Taq polymerase master mix, 2X Promega M7122
TBE Buffer Concentrate, 10X VWR E442
Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
Tissue paper Fisher Scientific 06-666
Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2)  Syndel 200-266
Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0)  Promega H5131

References

  1. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  2. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
  3. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  4. Troutwine, B. R., et al. The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine. Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).
  5. Xu, Y., Li, Z. CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).
  6. Creaser, C. W. The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year. Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).
  7. Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).
  8. Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish. Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).
  9. Gray, R. S., et al. Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish. Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).
  10. Brocal, I., et al. Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish. BMC Genomics. 17, 259 (2016).
  11. Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619 (2022).
  12. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  13. Hill, J. T., et al. Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
  14. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  15. Liu, Q., et al. Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems. Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).
  16. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
  17. Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
  18. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).

Play Video

Cite This Article
Voigt, B., Minowa, R., Gray, R. S. Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish. J. Vis. Exp. (192), e64686, doi:10.3791/64686 (2023).

View Video